新疆北部棉花黄萎病菌培养特性、致病型、致病性分化及ISSR遗传变异研究

刘廷利 ，惠慧 ，阚家亮 ，卢轩宇 ，花晟 ，范春晨 ，凌溪铁 ，王金彦 ，陈天子 ，杨郁文，艾尼江，赵建军，张保龙*

（1.江苏省农业科学院/江苏省农业生物学重点实验室，南京210014；2.新疆兵团石河子棉花研究所，新疆石河子832011）

新疆北部棉花黄萎病菌培养特性、致病型、致病性分化及ISSR遗传变异研究

刘廷利1，惠慧2，阚家亮1，卢轩宇1，花晟1，范春晨1，凌溪铁1，王金彦1，陈天子1，杨郁文1，艾尼江2，赵建军2，张保龙1*

（1.江苏省农业科学院/江苏省农业生物学重点实验室，南京210014；2.新疆兵团石河子棉花研究所，新疆石河子832011）

【目的】明确当前新疆北部棉区黄萎病菌菌系变异和致病力分析情况。【方法】从新疆北部植棉区获得17个棉花黄萎病菌单孢菌系，对其培养特性、致病型、致病力以及ISSR遗传变异进行了研究。【结果】供试17个菌株全部为菌核型，其中落叶型菌系（Defoliating type，D型）有13个，占76.5%；非落叶型菌系（Non-defoliating type，ND型）有4个，占23.5%；D型平均病指（58.72）略高于ND型平均病指（52.7）。在泗棉3号上D型平均病指高于ND型，而在奥3503上D型平均致病力低于ND型。供试菌株按强、中、弱三个致病力类型划分，分别占94.12%、5.88%和0%。ISSR遗传分化与致病型具有一定的相关性，大部分的D型和ND型处于各自不同分支。研究结果还发现，同一地块分离的菌株xj13-3①、xj13-3②和xj13-3③虽同为D型，但ISSR标记可将3个菌株分到不同的亚群上。【结论】试验结果表明了新疆北部棉花黄萎病菌遗传变异关系的复杂性。

大丽轮枝菌；致病力分化；培养性状；落叶型；非落叶型

棉花黄萎病俗称棉花的“癌症”，对世界各地棉花生产具有极大的危害性，每年造成减产10%～15%，是棉花生产第一大病害[1-3]。在我国，严重地区发病率在80%以上，每年发病面积222万～266万hm2，损失10多亿元[4]。棉花黄萎病的病原菌主要为大丽轮枝菌 （Verticillium dahliaeKleb.），可形成微菌核在土壤中存活10 a以上，其寄主范围广泛，能侵染660多种植物，包括番茄、茄子、马铃薯、黄瓜、棉花、烟草、辣椒等重要经济作物[2,5-6]。且该菌变异频繁，引起的病害控制始终是农业生产上一个亟待解决的重大难题。

鉴于黄萎病在棉花生产上的危害性，我国对棉花黄萎病菌的培养性状、致病力分化以及遗传变异已有大量的研究，并取得了显著的进展。早在1977―1978年，我国棉花黄萎病菌生理型联合试验组对8省（区）的10个黄萎病菌系用9个鉴别寄主接种鉴定后，将黄萎病菌分为3个生理型，分别为致病力强的生理型Ⅰ、致病力弱的生理型Ⅱ、致病力中等的生理型Ⅲ[7]。宋晓轩等[8]根据培养性状将黄萎病菌分为菌丝型、菌核型和中间型，其中菌丝型的致病力是菌核型的2倍左右；石磊岩等[9]对河北、河南、山东等地区黄萎病菌系进行了研究，发现强致病力落叶型菌系占供试菌株的41.5%。段维军等[10]发现新疆黄萎病菌存在强、中、弱3种致病类型，发现了落叶型菌株。袁洪波等[11]对石河子棉区的研究发现菌丝型菌株最多，占60%；其次是菌核型，占26.7%；中间型最少，为13.3%；致病力强、中、弱3个类型分别占73.3%，26.7%，0%。林玲等[12]对江苏37个菌株研究发现，菌核型占54.1%，菌丝型占24.3%，中间型占21.6%，致病力强、中、弱的菌株分别占27%，40.5%，32.4%。朱荷琴等[13]认为我国的棉花黄萎病菌在PDA（Potato dextrose agar）培养基上存在5种不同的培养类型，产生微菌核较多的B型为优势类群，占72.9%。黄萎病菌遗传变异的研究方法主要包括同工酶分析技术[9]、限制性片段长度多态性分析技术（Restriction fragment length polymorphism，RFLP）[14]、随机引物扩增多态性分析 （Random amplified polymorphic DNA，RAPD）[15]和简单序列重复区间扩增多态性（Inter-simple sequence repeat，ISSR）[16]等。 其中，ISSR 技术应用于棉花黄萎病菌的遗传多样性研究已有多例报道，如袁洪波等[11]、毛岚等[17]、王国宁等[16]分别利用ISSR技术分析棉花黄萎病菌遗传多样性，发现病原菌ISSR指纹与致病力或者地理来源存在明显的相关性。

新疆是我国棉花主产区，棉花黄萎病严重阻碍新疆棉花产业发展，明确棉花黄萎病在新疆棉区的病原种群的变化及致病性变异情况对制定相应的防控措施具有重要的意义[18]。本研究主要从新疆北疆植棉区采集棉花病株分离纯化棉花黄萎病菌，对其培养特征、致病性、致病类型以及ISSR遗传变异分化进行了研究，从分子水平上了解新疆棉花黄萎病菌的群体遗传特征，为新疆棉花抗病品种选育、引种以及黄萎病综合防控提供理论参考。

1 材料和方法

1.1 供试菌株

2014年从新疆北疆植棉区采集发病植株，通过单孢分离纯化法[11]得到17个棉花黄萎病菌菌株（表1），于－80℃保存备用。V991和BP2为对照菌株，由江苏省农业科学院植物保护研究所林玲博士馈赠。

1.2 菌株培养特性

将菌株接种于PDA培养基活化后，用打孔器取直径为0.5 cm的菌饼接种于新的PDA培养基，25℃黑暗培养10 d，十字交叉法测量菌落直径，15 d后观察菌落形态并拍照。菌核型菌丝发达致密或者疏松，微菌核多，底部黑色；菌丝型菌丝发达致密，无微菌核，底部为白色；中间型菌丝发达疏松，产生少量微菌核，底部为浅黑色[19]。

1.3 产孢量测量

在PDA上生长15 d的菌落边缘，用打孔器取直径为0.5 cm菌丝块置于1 mL无菌水中，剧烈震荡，然后用血球计数板计数，统计分生孢子产量。

表1 供试菌系基本情况及培养性状Table 1 The original information and cultural characteristics ofVerticillium dahliaein Xinjiang

1.4 供试菌株致病力检测

1.4.1供试棉花品种。棉花陆地棉感病品种泗棉3号和抗病品种奥3503为鉴别寄主。

1.4.2致病力测定。利用纸杯撕底菌液蘸根法接种鉴别寄主[20]。

1.4.3病情指数调查及划分标准。按棉花黄萎病苗期病情分级标准[21]，在棉花接种黄萎病菌后的第 15、20、25和30天，调查记载发病率、病情指数，以接种25 d后的病情指数划分供试菌株致病力的强弱，根据平均病情指数将黄萎病菌的致病性划分为强、中、弱3个类型[11]。

1.5 供试菌株致病型检测

利用CTAB(Hexadecyl trimethyl ammonium bromide)法提取各菌株的DNA，然后以特异引物D1、D2和 ND1、ND2[22]分别检测黄萎病菌株的落叶型和非落叶型类型，扩增片段分别为550 bp和1500 bp左右。PCR(Polymerase chain reaction)扩增程序按照文献[11]。

1.6 供试菌株ISSR分析

扩增引物参照袁洪波等[11]的9条ISSR引物，由南京金斯瑞生物公司合成。将各菌株的DNA稀释成 20 ng·μL－1，PCR 反应体系按照王国宁等[16]。PCR产物于2%的琼脂糖凝胶中电泳，每条引物重复扩增3～4次，记录可重复、清晰条带，同一位置有条带记为1，无条带记为0。利用NTsys2.10e软件中的tree plot功能进行树状聚类图分析[11]。

2 结果与分析

2.1 培养特性观察

将菌株活化后接种于PDA上，于第10天采用十字交叉法测量菌落直径，发现各供试菌株在菌落生长速度上存在明显差异，其中对照菌株V991和菌株xj13-2②生长速度最快，菌落直径达到 4.92 cm； 菌 株 xj13-2③、xj13-3②、xj13-7、xj13-21和对照BP2菌落直径均在4 cm以下，生长速率相对较慢（表1）。培养15 d后，根据菌落形态特点，所有供试菌株均为菌核型 （图1，表1），正面和背面均产生大量微菌核，没有发现菌丝型菌株（图1）。对平板上培养15 d的产孢量进行测定发现，菌株之间产孢量差异较大，菌丝型菌株 V991 产孢量最少，仅为 0.32×108mL－1；菌核型菌株xj13-26②产孢量最高，为5.79×108mL－1，两个菌株相差18倍。

图1 供试菌株培养特性Fig.1 Cultural characteristics of tested isolates

2.2 致病力检测

各菌株在2个棉花品种上均能产生明显的发病症状，平均病指为33.71～74.95（表2），表现出明显的致病力分化现象。所有菌株在泗棉3号上的平均病指为68.82，在奥3503上的平均病指为45.98，抗病品种的平均病指比感病品种的平均病指低。根据平均病情指数将菌株划分为强、中、弱3个类型（表2），其中强致病力菌株16个，占94.12%；仅xj13-2③为中等致病力菌株。表明新疆北部棉区棉花黄萎病菌以强致病力菌株为主。

表2 供试菌株致病力和致病型检测Table 2 Pathogenicity and pathotype of tested isolates

2.3 致病型检测

利用致病型检测引物D1、D2和 ND1、ND2鉴定菌株的致病型。引物D1、D2能够鉴定落叶型菌株，引物ND1、ND2能够鉴定非落叶型菌株。鉴定结果（图 2）表明，菌株 xj13-3①、xj13-3②、xj13-3③、xj13-12、xj13-20①、xj13-20②、xj13-20③ 、xj13-21、xj13-24、xj13-25、xj13-26 ① 、xj13-26②和xj13-26③扩增出了大小为550 bp左右的条带，与落叶型对照菌株V991一样，为落叶型菌株（图 2，上），这类菌株有 13个，占 76.5%；菌株xj13-2①、xj13-2②、xj13-2③和 xj13-7 扩增出1500 bp条带，与对照BP2一样，为非落叶型菌株（图2，下），这类菌株有4个，占供试菌株的23.5%。表明目前新疆北部棉区棉花黄萎病菌以落叶型菌株为主。

2.4 供试菌株ISSR指纹分析

图2 供试菌株致病类型检测Fig.2 PCR analysis of the pathogenicity category of tested isolates

为了明确黄萎病菌的遗传变异，利用9条ISSR引物[11]对供试菌株进行PCR扩增，V991、BP2为对照菌株。以扩增结果构建聚类树形（图3），在遗传相关系数0.48处，可以将所有菌株分为2类：第Ⅰ类中共10个菌株，包含落叶型菌株5个和非落叶型菌株5个。落叶型菌株分别为xj13-3②、xj13-3③、xj13-26①、xj13-25 和 xj13-24，非落叶型菌株为 xj13-2①、xj13-2②、xj13-7、BP2和xj13-2③，其中xj13-2③为中等致病力菌株；第Ⅱ类共9个菌株，其中包含对照菌株V991，均为落叶型菌株。在相关系数0.61处，第I类可分为两个分支，第1个分支的5个菌株中，仅xj13-2②为非落叶型，其他均为非落叶型；第2个分支仅xj13-24为落叶型，其他均为非落叶型。表明虽然个别菌株之间遗传变异较小，如菌株xj13-21和V991的相关系数为1，总体而言，供试菌株间遗传变异较大，ISSR遗传聚类与致病型具有很强的相关性，落叶型菌株和非落叶型菌株可分化到各自的分支上。

图3 ISSR指纹聚类关系Fig.3 Phylogenetic relationships of isolates based on ISSR fingerprint analysis

3 结论与讨论

黄萎病一直是棉花生产上为害最严重的病害之一，目前生产上陆地棉尚无高抗病品种[23]。棉花田间黄萎病菌菌系组成复杂，致病性分化明显。同一棉区经过多年的棉花种植，菌系组成经常发生变化[8-9,12-13]。因此，有必要对植棉区进行致病力分化的监测，明确棉花黄萎病菌群体的致病力、致病型以及遗传变异特征，对棉花黄萎病抗病育种以及综合防治具有重要的指导作用。

3.1 产孢量、生长速率和致病力之间的关系

本研究所用的17个供试菌株在产孢量和生长速率方面皆有很大的不同。对照菌丝型菌株V991在PDA平板上生长速率最快，气生菌丝发达，但产孢量最低，与产孢量较低的菌株xj13-20①的致病性属于中等水平；产孢量最高的菌株xj13-26②的菌落直径为4.12 cm，低于菌株xj13-2②（菌落直径为4.92 cm）。产孢量和生长速率之间的相关系数为0.05，产孢量和平均病指之间的相关系数为0.25，生长速率和平均病指的相关系数为0.09，相关系数均较低，表明产孢量、生长速率和致病力之间无明显关系。这与林玲等[12]研究结果一致。

3.2 菌株致病性分化与寄主的关系

总体来看，感病品种泗棉3号的病情指数和发病率高于抗病品种奥3503的病指。但是一些菌株，例如xj13-2②、xj13-2③和BP2在泗棉3号上的致病力低于它们在奥3503上的致病力，表明菌株的致病力和使用的品种有关。因此，对于黄萎菌致病力的判定，常常使用多个鉴别寄主，用平均病指来衡量菌株致病力的强弱[11-12]。这虽然在一定程度上可以判断一个菌株致病力的强弱，但对于抗病基因和无毒基因的克隆以及抗病品种的布局来说，针对单一菌系、单一品种的抗性鉴定，更能反应一个菌株致病力特点并具有更好的应用价值。因此，建立一套适用于棉花黄萎病菌的鉴别寄主非常必要。

3.3 菌株培养性状与致病力的关系

本研究中所有的供试菌株均为菌核型，对照菌株V991为菌丝型，仅有3个菌核型菌株致病力比V991弱，其他菌株致病性均比V991致病力强，表明培养性状与致病力无相关性。这与林玲等[12]研究结果一致。

3.4 落叶型菌株划分的依据

本研究供试的17个菌株加两个对照菌株，根据分子标记划分，可分为14个落叶型和5个非落叶型，与在感病品种上的表型一致。根据抗病品种奥3503观察到的表型，落叶型菌株仅有8个；在泗棉3号上，落叶型菌株有V991、xj13-3①、xj13-3②、xj13-12、xj13-20③和 xj13-25，但它们在奥3503上为非落叶表型。表明落叶症状和使用的品种有关，这与林玲等[12]的研究结果一致。本研究分子标记结果和在泗棉3号上表型一致，表明用感病品种泗棉3号的表型可作为落叶型和非落叶型菌株划分的依据。

3.5 ISSR遗传变异

根据ISSR引物将所有的19个菌株进行聚类分析，结果发现，落叶型菌株和非落叶型菌株可划分在不同的分支，表明落叶菌株和非落叶型菌株在遗传距离上是有差距的，这与Perez-Artes等[22]的研究结果一致，这为鉴定控制落叶的基因提供了保障。

3.6 培养性状与是否为落叶型菌株的关系

石磊岩等[24]研究表明，菌丝型菌株为落叶型菌株，而菌核型为非落叶型菌株。本研究中17个供试菌株均为菌核型菌株，包括13个落叶型菌株和4个非落叶型菌株，表明培养性状和致病型无相关性。另外，菌株的培养性状会出现变异。袁洪波等[11]、林玲等[12]认为是中间型的菌株BP2，在本研究中表现为菌核型。王克荣等[25]认为野生型的菌核型菌株在人工培养条件下，有3.6%的可能性会突变为菌丝型菌株。Duressa等[26]认为菌核型菌株VdLs17在培养过程中，可出现菌丝型和菌核型两种表型，表明大丽轮枝菌在培养过程中会产生变异，但具体机制未知，值得进一步研究。

4 结论

本研究对新疆北部棉区的17个棉花黄萎病菌菌株进行了培养性状、致病型、致病力和遗传距离分析，明确了目前其在新疆北部棉区以菌核型为主，强致病力菌株达到94.12%以上，表明新疆北部棉区棉花黄萎病存在加重的趋势，采用对应的防治方法显得尤为必要，例如进行土壤消毒。本研究的不足之处是未建立一套标准的鉴别寄主，对黄萎菌的致病力做详细的划分。鉴于目前国内无统一的鉴别寄主，因此，有必要建立一套全国通用的鉴别寄主，将为菌株致病性鉴定，抗性鉴定的标准化奠定基础。

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The Monitoring of Cultural Characteristics,Pathotype,Pathogenicity Differentiation and ISSR Genetic Variation ofVerticillium DahliaeIsolates from Cotton in Northern Xinjiang

Liu Tingli1,Xi Hui2,Kan Jialiang1,Lu Xuanyu1,Hua Sheng1,Fan Chunchen1,Ling Xitie1,Wang Jinyan1,Chen Tianzi1,Yang Yuwen1,Ai Nijiang2,Zhao Jianjun2,Zhang Baolong1*
(1.Provincial Key Laboratory of Agrobiology/Jiangsu Academy of Agricultural Sciences,Nanjing210014,China;2.Shihezi Cotton Research Institute,Xinjiang Production and Construction Group,Shihezi,Xinjiang832011,China)

[Objective]This research focused on determining the strains variation and pathogenic differentiation ofVerticillium dahliaefrom cotton in north of Xinjiang.[Method]SeventeenVerticillium dahliaesingle spore strains were recovered from cotton in northern Xinjiang.Cultural characteristics,pathotype,pathogenicity and ISSR genetic variation of these strains were studied.[Result]The results indicated that all the examined strains were sclerotia type and the defoliating and non-defoliating strains accounted for 76.5%and 23.5%,respectively.The average disease index of defoliating strains(58.72)was slightly higher than non-defoliating strains(52.7).Comparing with nondefoliating strains,defoliating strains had higher disease index on Simian 3 cultivar and lower disease index on Ao 3503.Based on average disease index,the tested isolates could be divided into strong pathogenic type,middle pathogenic type and weak pathogenic type.No strains were weak pathogenicity,while the strong pathogenic strains and middle strains occupied for 94.12%and 5.88%,respectively.The genetic variation of these isolates was wide from ISSR fingerprint analysis and had certain correlation to pathotype.Most of the defoliating strains and non-defoliating strains were in different clades,respectively.The results also showed three defoliating strains xj13-3①,xj13-3② and xj13-3③isolated from the same field were in different sub-clades.[Conclusion]These results indicate complicated genetic variation ofVerticillium dahliaein northern Xinjiang.

Verticillium dahliae;pathogenicity differentiation;cultural characteristics;defoliating;non-defoliating

S435.621 文献标志码：A

1002-7807(2017)06-0541-09 DOI：10.11963/1002-7807.ltlzbl.20170927

2016-12-31

刘廷利（1982―），男，博士，tlliu2100@163.com。*通信作者：zhbl2248@hotmail.com

江苏省杰出青年基金（BK20160016）；江苏省自然科学基金青年基金（BK20140743）；国家自然科学基金面上项目（31671980）；国家自然科学基金青年科学基金（31401694）；科技支疆项目（2013AB004）