EDTA高压修复法在石蜡包埋组织HPV原位杂交检测中的应用

慈思慧，开 蕾，张二春，彭 钧

迈新·技术交流

EDTA高压修复法在石蜡包埋组织HPV原位杂交检测中的应用

慈思慧，开 蕾，张二春，彭 钧

HPV；原位杂交；EDTA

人乳头瘤状病毒(human papillomavirus, HPV)感染与子宫颈癌的发生、发展密切相关，应用原位杂交法检测石蜡包埋子宫颈组织中HPV DNA的表达具有重要的辅助诊断意义[1-2]。现行试剂盒采用增强液微波修复进行预杂交，实验要求高，操作时间长，作者在实践中应用EDTA高压修复法替代增强液微波修复进行预杂交，对比发现操作更为简便、省时，且结果可靠，现介绍如下。

1 材料与方法

1.1材料随机选取安庆市立医院病理科2013年～2015年送检的子宫颈活检组织70例。

1.2试剂HPV(6/11型、16/18型)试剂盒购自福建泰普公司；EDTA(pH 9.0)(20×)、PBS缓冲液(pH 7.4)(20×)均购自福建迈新公司；阳性对照片由泰普公司提供。

1.3方法(1)切片、烤片：用徕卡切片机切片，制成3 μm厚的石蜡切片黏附于防脱片的载玻片上，60 ℃烤片30 min。(2)脱蜡：切片从烤箱中取出迅速置于二甲苯中3次，每次5 min，无水乙醇5 min，95%乙醇5 min，80%乙醇5 min，流水冲洗10 min。(3)增强组织的通透性和核酸探针的穿透性：基本方法：试剂盒说明书提供步骤，使用试剂盒内提供增强液，微波10 min×3次，流水冷却10 min，再置于去离子水中1 min；新方法：EDTA(pH 9.0)(20×)用去离子水稀释后，高压喷气6 min，流水冷却10 min，置于去离子水中1 min。(4)杂交：根据组织大小滴加杂交液10～20 μL，盖上洁净的盖玻片，将切片置于原位杂交仪中95 ℃ 5 min，迅速取出后置于湿盒内，放入37 ℃恒温箱4～16 h。(5)检测：取出切片，轻轻去除盖玻片后将切片置于52 ℃ PBS缓冲液中浸泡3次，每次5 min，擦干组织周围液体，滴加50 μL试剂A，37 ℃ 30 min；取出切片置于37 ℃ PBS缓冲液中浸泡3次，每次3 min，擦干组织周围液体，滴加50 μL试剂B，室温20 min；取出切片置于室温PBS缓冲液中浸泡3次，每次3 min，擦干组织周围液体，滴加50 μL试剂C，室温30 min；取出置于室温PBS缓冲液中浸泡3次，每次3 min。(6)显色：根据需要配置足够的DAB显色液，室温显色3 min，可镜下控制时间。(7)复染、封片：显色后的切片流水冲洗3 min，置于Mayor苏木精中复染30 s，盐酸乙醇分化5 s，温水返蓝，脱水、透明、封片。

2 结果

鳞状上皮细胞核内出现棕褐色粗颗粒即判为阳性，对随机选取的70例组织使用基本方法检测HPV6/11型阳性20例、阴性50例(图1A)，新方法检测HPV6/11型阳性23例、阴性47例(表1，图1B)；使用基本方法检测HPV16/18型阳性36例、阴性34例(图2A)，新方法检测阳性38例、阴性32例(表2，图2B)。

①A①B②A②B

图1A.基本方法检测HPV6/11型结果；B.新方法检测HPV6/11型结果图2A.基本方法检测HPV16/18型结果；B.新方法检测HPV16/18型结果

表1 使用基本方法和新方法检测HPV6/11型结果对比

χ2=0.67，P>0.05

表2 使用基本方法和新方法检测HPV16/18型结果对比

χ2=0.50，P>0.05

3 讨论

增强组织通透性常用的方法有：利用稀释的酸、去垢剂或某些消化酶等。这种去蛋白作用较广泛，在增强组织通透性、提高核酸探针穿透性和提高杂交信号的同时，也会影响组织结构的形态，因此对于用量和时间的把握极其重要。

现在常用的增强组织通透性的方法多为蛋白酶K或者胃蛋白酶，其配方中有的含有一定量的EDTA，故而作者尝试使用EDTA(pH 9.0)稀释后增强组织的通透性和核酸探针的穿透性，其结果与使用试剂盒配套的增强液效果基本一致，作者推测可能是由于在高温高压条件下EDTA破坏了靶DNA周围的蛋白质，或者是打开了核酸探针穿透的通路以促进探针的渗透。两种方法检测的结果有一定的差异，原因可能是：(1)由于是手工操作，在操作过程中可能存在一定的差异导致了结果的差异；(2)可能是新方法检出了基本方法漏检的病例，但是这种可能性还需要进一步采用PCR、FISH或者其他方法进一步检测验证。

本组实验结果显示，改用EDTA(pH 9.0)高压修复的检出结果和试剂盒提供的方法检出结果差异无统计学意义，因而可以推测两种方法的阳性率基本一致，检测效果是相似的，同时新方法在增强组织的通透性和核酸探针的穿透性的操作上较为省时、便捷。但是，由于实验检测病例数较少，同时还缺乏其他检测方法加以验证，因而下一步实验将尝试扩大样本量，并采用其他检测手段进行检测验证，还可以观察不同高压时长期检出的结果是否有差异。

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1001-7399(2017)10-1161-02

时间：2017-10-23 13:30 网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20171023.1330.027.html

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.10.027

接受日期：2017-04-12

安庆市立医院病理科，安庆 246000

慈思慧，女，硕士，技师。E-mail: 403688662@qq.com