血清反应因子全长及N端片段过表达慢病毒载体的构建及其对心脏干细胞分化的影响

雷 洪，王可可，哈艳平，贾亚楠，李汝佳，申志华，郭峻莉，揭 伟

血清反应因子全长及N端片段过表达慢病毒载体的构建及其对心脏干细胞分化的影响

雷 洪1，王可可1，哈艳平1，贾亚楠2，李汝佳1，申志华2，郭峻莉3，揭 伟1

目的探讨血清反应因子全长(SRF-Full)及N端片段(SRF-N,1-254aa)对TGF-β1诱导c-Kit+心脏干细胞(cardiac stem cell, CSC)分化的影响。方法从cDNA文库扩增大鼠SRF-Full及SRF-N表达序列并克隆入酶切线性化慢病毒载体GV358(Ubi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin)，转化感受态细胞筛选出阳性克隆并测序鉴定。将SRF-Full及SRF-N过表达质粒与病毒包装辅助质粒共转染工具细胞HEK293T，包装慢病毒。磁激活细胞分选法分离乳SD大鼠c-Kit+CSC，将SRF-Full及SRF-N过表达慢病毒感染CSC并经TGF-β1诱导，定量PCR分析下游分化基因mRNA水平的变化。结果成功扩增出SRF-Full及SRF-N编码序列并正确连接入线性化载体，获得的阳性转化子经测序无误。将转化子质粒与病毒包装辅助质粒共转染HEK293T后，获得滴度为2×108TU/mL的慢病毒颗粒，Western blot检测到预期Flag融合蛋白。重组慢病毒感染CSC后细胞核中见eGFP信号。TGF-β1诱导CSC出现心肌细胞分化基因(Nkx2.5、Gata4、cTnI)及平滑肌细胞分化基因(SM22α)的表达，内皮细胞分化(vWF)无影响，SRF-Full促进CSC的心肌细胞分化，而SRF-N则抑制这种分化。结论成功构建SRF-Full及SRF-N过表达重组慢病毒质粒。SRF-Full促进而SRF-N减弱TGF-β1诱导CSC的心肌细胞分化。

血清反应因子；血清反应因子N端片段；质粒构建；心脏干细胞；细胞分化

干细胞移植治疗缺血性心脏病是当前心脏再生医学研究的重点与热点之一。研究表明，干细胞参与受损心肌组织修复的机制主要是旁分泌而非直接的细胞分化[1-3]。影响干细胞分化的因子众多。血清反应因子(serum response factor, SRF)是一种高度保守且广泛存在于多种生物体内的转录调控因子，属于MADS转录因子家族，其通过结合CArG序列[CC(A/T)6GG]实现时空特异性调控超过200个下游靶基因的转录表达，这些基因涉及细胞生长、迁移、骨架形成和成肌过程。在人类慢性心衰组织中SRF可被Caspase 3剪接成N片段(SRF-N, 1-254aa)及C片段(SRF-C, 255-508aa)[4-5]。由于N片段含有MADS结合域但不含有催化结构域，因此，SRF-N可与SRF全长(SRF-Full)竞争性结合靶基因的CArG盒因而影响下游编码心肌收缩等基因的转录激活，从而恶化心功能。作者假设心肌梗死等损伤后局部移植干细胞中SRF很可能同样被剪切而产生SRF-N片段，进而对移植的干细胞生物学功能产生不利的影响。目前尚未见有关SRF-N与干细胞分化的报道。c-Kit+心脏干细胞(cardiac stem cell, CSC)是具有多向分化潜能的成体细胞，在心肌损伤再生研究中获得较多的关注[6-8]。本文旨以转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)诱导c-Kit+CSC分化为模型，分析SRF-N对TGF-β1信号诱导下c-Kit+CSC分化的影响，为推进干细胞移植治疗缺血性心脏病的转化医学奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞、质粒及菌株 乳SD大鼠c-Kit+CSC为原代分离。HEK293T细胞、大肠杆菌感受态细胞DH5α、慢病毒载体GV358(Ubi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin)、慢病毒包装辅助质粒pHelper 1.0及pHelper 2.0、阴性对照慢病毒均购自上海吉凯公司。

1.1.2主要试剂 cDNA文库为上海吉凯公司产品；In-Fusio PCR Cloning试剂盒购自Clontech公司；Taq聚合酶购自SinoBio公司；dNTP、RT及Real-time PCR试剂盒为Takara公司产品；限制性内切酶购自NEB公司；质粒抽提试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自TIANGEN公司；Trizol、FBS、DMEM、Opti-MEM和Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司；PCR引物由上海生工公司合成；抗Flag一抗为Sigma产品，HRP标记抗鼠二抗购自Santa Cruz公司；干细胞专用培养基购自广州赛业公司；重组大鼠TGF-β1为Proptech产品。

1.1.3实验动物 出生72 h以内的乳SD大鼠购自广东医科大学实验动物中心，动物合格证号SYXK(粤)2015-0147，有关动物实验操作均符合相关伦理学规定。

1.2方法

1.2.1SRF-Full和SRF-N慢病毒表达质粒的构建和鉴定 人SRF-Full可被Caspase 3剪切成含1-254 aa的SRF-N及255-508 aa的SRF-C片段[4-5]，目前未见有关大鼠SRF剪切体的报道。根据大鼠及人类SRF蛋白一级结构特征，实验设想同样于254aa处将大鼠SRF-Full剪切成2个片段。根据GeneBank中大鼠SRF(NM_001109302)的基因序列信息，采用PCR法从cDNA文库调取SRF-Full及SRF-N端蛋白质编码序列。引物如下：SRF-Full序列，上游5′-GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGTTACCGAGCCAAGCTG-3′，下游5′-TCCTTGTAGT CCATACCGGTTTCACTCTTGGTGCTGTGGGTG-3′，产物长度1 559 bp；SRF-N序列：上游5′-GAGGAT CCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGTTACCGAGCCAAGCTGGG-3′，5′-TCCTTGTAGTCCATACCTTCCCCACTGCTGTCAGATTCC-3′，产物长度806 bp。引物含交换配对碱基、酶切位点(加粗，斜体)和增强序列(下横线)。慢病毒质粒GV358经AgeⅠ酶切后得到线性化片段，将线性化载体和目的基因(SRF-Full及SRF-N)按摩尔数比例为1 ∶2混合，25 ℃ 30 min进行交换反应，形成带有目的基因的重组慢病毒载体。将连接好的产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆送Invitrogen公司进行测序鉴定，大量提取阳性克隆质粒DNA备用。

1.2.2重组SRF-Full及SRF-N过表达慢病毒的包装、纯化及鉴定 参考文献报道[9]进行操作，HEK293T细胞接种15 cm细胞培养皿，37 ℃ 5%CO2培养箱内培养，待细胞密度达70%～80%时用于转染。将20 μg重组质粒Ubi-SRF-Full-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin、Ubi-SRF-N-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin，15 μg辅助质粒pHepler 1.0及10 μg pHepler 2.0与Opti-MEM混匀于同一试管，总体积为2.5 mL，室温孵育5 min；将100 μL Lipofectamine 2000与2.4 mL Opti-MEM混匀于另一试管，室温下孵育5 min；将两试管液体混合，室温作用20 min后加入HEK293T细胞培养皿中，常规培养8 h后弃去上清并更换新鲜完全培养液20 mL，继续培养48 h，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，0.45 μm滤器得到粗提病毒液，将病毒粗提液转移至过滤杯中，4 000g离心10～15 min后得到高滴度的慢病毒浓缩液，分装后保存在-80 ℃。取一支病毒液，应用ELISA检测HIV-1 p24抗原法判断其滴度。取另外一支病毒液，按MOI值20感染HEK293T细胞，48 h后提取总蛋白，采用Western blot法检测SRF-3Flag融合蛋白的表达。

1.2.3CSC的分离、培养、鉴定、病毒感染及诱导分化 参考干细胞分选法[10-12]分离原代乳SD大鼠c-Kit+CSC。乳鼠心脏机械剪碎后经胰酶及胶原酶多次消化成细胞悬液，血清终止消化，冷PBS洗涤细胞，800g离心10 min后弃上清，细胞沉渣用4 mL DMEM液混匀，加入抗c-Kit一抗(1 ∶250)及FBS(0.5%)，垂直混合仪室温下以5 r/min缓慢混合40 min，800g离心10 min弃上清，PBS洗2遍，细胞用4 mL DMEM混悬，加入10 μL偶联二抗的磁珠，垂直混合仪室温下以5 r/min缓慢混合30 min，将细胞悬液过磁柱，c-Kit+细胞在磁场中被吸附，弃去液体，用干细胞专用培养基冲洗磁柱，洗脱的细胞即为c-Kit+CSC。CSC置于37 ℃ 5%CO2饱和湿度的培养箱中培养，每3天换液(培养液中含抑制细胞分化的白血病抑制因子)。采用流式细胞术检测c-Kit+细胞纯度。取状态良好的CSC接种于6孔板中(2×104/mL)，24 h后细胞贴壁，状态生长良好，弃去培养基，PBS洗2遍，以感染复数为100加入慢病毒颗粒和DMEM(1 mL)孵育，8～10 h后加1 mL完全培养液置于37 ℃ 5%CO2饱和湿度培养箱内培养24 h，然后吸去含病毒的培养液，每孔加入2 mL完全培养基培养，72 h后在荧光显微镜下观察感染效果，以嘌呤霉素3 μg/mL进行筛选用于后续实验。实验分组：阴性对照慢病毒感染组(NC组)、全长SRF过表达慢病毒感染组(SRF-Full组)、SRF-N过表达慢病毒感染组(SRF-N组)。以终浓度10 ng/mL的外源性TGF-β1分别处理3组细胞，于第2、7天后提取总RNA。

1.2.4RNA提取、逆转录及定量PCR 参考文献报道[13]进行。Trizol裂解细胞提取总RNA，取100 ng总RNA逆转录为cDNA，按照定量PCR试剂盒说明书进行。PCR反应体系为20 μL，含SYBR Premix Ex Taq 10 μL，cDNA 5 μL，上游及下游引物各1 μL，DEPC水3 μL。PCR反应条件为95 ℃预变性5 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s共55个循环。采用2-ΔΔCt相对定量法，以β-actin为内参照分析心肌细胞、平滑肌细胞及内皮细胞标志基因mRNA水平的改变。PCR引物序列如下：Nkx2.5(NM_053651.1)：上游5′-CAGGTCTATGAGCTGGAGCG-3′，下游5′-TTACACTTGTAGCGGCGGTT-3′；Gata4(NM_144730)：上游5′-ATGGGTCCTCCATCCATCCA-3′，下游5′-GCTGTTCCAAGAGTCCTGCT-3′；cardiac Tropnin I3(cTnI, NM_017144.2)：上游5′-TATGACCTGCGTGGCAAGTT-3′，下游5′-GCCCTCAGGTCCAAGGATTC-3′；SM22α(NM_031549)：上游5′-CTGTAATGGCTTTGGGCAGT-3′，下游5′-CTCTTATGCTCCTGGGCTTTC-3′；vWF(NM_053889.1)：上游5′-ACTTCACCTTCAGTGGCATCT-3′，下游5′-AGACAGCATCAGGGTCATCAG-3′；β-actin(NM_031144)：上游5′-CCCATCTATGAGGTTACGC-3′，下游5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′。

1.2.5Western blot 提取SRF-Full、SRF-N及NC组病毒感染HEK293T 48 h后的总蛋白，BCA法定量蛋白浓度，取30 μg蛋白用于SDS-PAGE。蛋白转移至PVDF膜，经脱脂奶粉封闭后加入一抗(Flag，1 ∶3 000；GAPDH，1 ∶3 000)4 ℃孵育过夜，TBST洗涤，羊抗小鼠HRP标记IgG二抗(1 ∶4 000)室温孵育2 h，ECL发光后获得目的蛋白条带，胶片经凝胶成像系统扫描、拍照。

2 结果

2.1重组SRF-Full及SRF-N过表达慢病毒质粒的构建及鉴定从cDNA文库成功获得SRF-Full及SRF-N蛋白编码序列，大小与预期结果一致。通过序列交换法，将此序列克隆入经Age I酶切后线性化慢病毒质粒GV358，转化感受态DH5α细胞获得阳性克隆，挑选阳性克隆经测序证实序列无误(图1)，提示重组慢病毒质粒Ubi-SRF-Full-3FLAG- SV40-EGFP-IRES-puromycin及Ubi-SRF-N-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin构建成功，大量提取质粒备用。

图1 重组SRF-Full和SRF-N过表达慢病毒质粒的构建

A.从cDNA文库中调取SRF-Full蛋白质编码序列PCR产物凝胶电泳结果，1.DNA Marker，2.SRF-Full cDNA产物，长度为1 559 bp；B.重组SRF-Full过表达慢病毒质阳性克隆部分测序结果；C.从cDNA文库中调取SRF-N蛋白质编码序列PCR产物凝胶电泳结果，1.DNA Marker，2.SRF-N cDNA产物，长度为806 bp；D.重组SRF-N过表达慢病毒质阳性克隆部分测序结果

2.2SRF-Full及SRF-N过表达慢病毒颗粒的包装、扩增及鉴定分别将Ubi-SRF-Full-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin及Ubi-SRF-N-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin、pHelper1.0和pHelper2.0三个质粒共转染HEK293T细胞，在辅助质粒的支持下，成功获得重组SRF-Full及SRF-N过表达慢病毒，ELISA法测得病毒滴度均为2×108TU/mL。提取慢病毒感染HEK293T细胞总蛋白后，成功应用Western blot法从RIPA裂解产物中检测到SRF-Full-3Flag及SRF-N-3Flag融合蛋白的表达，蛋白大小与预期结果一致。同时，慢病毒感染HEK293T后在荧光显微镜下观察到eGFP产生的绿色荧光信号(图2)。上述结果提示本实验成功获得高滴度的SRF-Full及SRF-N过表达重组慢病毒。

2.3c-Kit+CSC的分选、鉴定及重组慢病毒感染采用文献报道[10-12]的磁激活细胞分选法成功分选出c-Kit+CSC。刚分选的CSC胞体较小，呈圆形，部分细胞上附有磁珠，培养24 h后细胞贴壁生长，逐渐变成梭形，约7天有克隆形成，细胞呈漩涡状生长，21天时生长汇合，细胞呈纤维状。经流式细胞术检测纯化分选2次后c-Kit+细胞纯度超过95%(图3)。后续试验均以纯化2次传代5次的细胞进行。CSC接种6孔板24 h后贴壁，按照感染复数指数(multiplicity of infection, MOI)为100加入重组SRF-Full、SRF-N过表达及NC对照慢病毒，24 h后镜下观察细胞形态无明显变化，72 h后荧光显微镜下观察到CSC中有明显的胞核绿色荧光信号，提示SRF-Full及SRF-N过表达慢病毒成功进入细胞(图4)。

图2 重组慢病毒鉴定

A.Western blot法检测SRF-Full-3Flag融合蛋白表达；1.阳性对照(Survivin-3FLAG-GFP)；2.阴性对照HEK293T；3.SRF-Full-3Flag；B.SRF-Full过表达慢病毒感染HEK293T 96 h(明视野)；C.SRF-Full过表达慢病毒感染HEK293T 96 h(荧光视野)；D.Western blot法检测SRF-N-3Flag融合蛋白表达；1.阳性对照(Survivin-3FLAG-GFP；2.阴性对照HEK293T；3.SRF-N-3Flag；E.SRF-N过表达慢病毒感染HEK293T 96 h(明视野)；F.SRF-N过表达慢病毒感染HEK293T 96 h(荧光视野)

图3 CSC形态及纯度

A.CSC低倍视野；B.CSC高倍视野；C.IgG对照流式结果；D.纯化2次CSC中c-Kit流式结果

图4 重组慢病毒感染乳鼠c-Kit+CSC 72 h后荧光效果

2.4TGF-β1信号对c-Kit+CSC分化的影响c-Kit+CSC接种6孔板后给予10 ng/mL外源性TGF-β1诱导分化，于诱导第2、7天收获细胞，定量PCR检测心肌细胞分化标志基因(Nkx2.5、Gata4、cTnI)及平滑肌细胞分化基因(SM22α)和内皮细胞分化(vWF)mRNA水平的改变。结果显示TGF-β1信号有效上调Nkx2.5、Gata4、cTnI及SM22α mRNA的水平，而对vWF mRNA无明显诱导作用(图5)。

图5 TGF-β1信号对c-Kit+CSC分化的影响*P<0.05；N.S表示差异无统计学意义

2.5SRF-Full及SRF-N过表达对TGF-β1信号诱导c-Kit+CSC分化的影响分别用SRF-Full组、SRF-N组和NC组按MOI值100感染CSC，7天后定量PCR检测TGF-β1诱导的心肌细胞、平滑肌细胞标志基因(TGF-β1对CSC内皮细胞分化无明显作用)mRNA水平的变化。结果显示，与对照组相比，SRF-Full处理7天后心肌细胞早期分化标志基因Nkx2.5和Gata4 mRNA水平上升明显，晚期分化标记基因cTnI未见明显上升，平滑肌分化标志基因SM22α mRNA明显上升(图6)。

图6 SRF-Full及SRF-N过表达对TGF-β1信号诱导c-Kit+CSC分化的影响

A.Nkx2.5 mRNA；B.Gata4 mRNA；C.cTnI mRNA；D.SM22α mRNA；*P<0.05；**P<0.001；***P<0.001

3 讨论

SRF表达异常与人类某些疾病的病理生理过程关系密切，如肿瘤、纤维化、神经损伤再生及心功能衰竭等[14]。动物实验表明，过表达SRF可诱导肥厚性心肌病，而基因敲除SRF可导致心脏发育畸形，表现为小梁形成障碍、心壁变薄和心腔扩张[15-16]。研究发现，老年大鼠相对年轻大鼠其急性心肌梗死后心脏中SRF升高趋势减弱，提示老年心脏对急性应急的反应欠佳[17]。Chang等[5]报道，人类慢性心衰心脏组织中SRF-Full可被Caspase 3剪切成SRF-N和SRF-C，SRF-N具有DNA结合序列但失去调控序列因而可与全长SRF竞争性调节下游靶基因的表达，如抑制心肌细胞α-肌动蛋白的转录，导致心肌收缩力减弱，最终形成心力衰竭。上述动物水平及临床前研究结果提示，维持合适的SRF表达及活性对心脏发育、自稳及心功能的保持至关重要。

干细胞移植治疗心肌梗死的理想结果是移植的干细胞能通过有效分化来替代、补充受损的心肌组织、改善心功能。心肌细胞和平滑肌细胞众多的分化标志基因其DNA序列均具有特殊的CArG盒元件，SRF通过与CArG序列结合，与其他辅助因子一起构成三元复合物，精细地调控分化基因的表达。因此，SRF对心肌梗死后移植干细胞的生物学功能至关重要。已经证实，基因敲除SRF后对胚胎干细胞成肌分化影响显著[18]。本课题组前期实验初步证实，与常氧培养为对照，乳大鼠心肌细胞经低氧刺激后总SRF表达水平减弱，但小片段的剪切片段却增加明显(未发表资料)，目前对这些剪切片段的生物学功能尚不清楚。鉴于大鼠和人SRF蛋白同源性极大，本组实验参考Chang等[5]的报道，将1-254 aa认为是SRF-N，该氨基酸序列具有保守的MADS序列，因而具备DNA结合能力。为此，本组实验首先利用cDNA文库，应用PCR调取了SRF-Full和SRF-N的编码序列，将其分别克隆入慢病毒载体GV358，构建和筛选SRF-Full及SRF-N的过表达慢病毒质粒，经过有效的包装，获得高滴度的过表达慢病毒颗粒。进一步鉴定结果证实所包装的慢病毒能表达Flag融合蛋白，可高效感染工具细胞。因此，SRF-Full和SRF-N过表达慢病毒的有效包装及感染验证，为后续干细胞中的功能研究奠定基础。

c-Kit+CSC是心脏固有成体干细胞中最常见的一种类型，在较多的临床前研究及部分Ⅰ期临床研究中得到重视[6]。考虑到从幼年个体中分离的CSC较成年个体中CSC具有更高的细胞活性[19]，因而本实验应用成熟的MACS法从乳SD大鼠心脏组织中提取c-Kit+CSC，经2次纯化后其纯度为95%以上。在外源性TGF-β1诱导下，7天后心肌细胞分化标记基因Nkx2.5、Gata4和cTnI，平滑肌细胞分化标志基因SM22α的转录水平明显增强，而内皮细胞分化相关基因vWF转录本却未见明显增加，提示c-Kit+CSC是多能干细胞，在TGF-β1诱导下主要向心肌细胞和平滑肌细胞分化为主。随后，以MOI值为100将相应SRF-Full及SRF-N慢病毒感染CSC，荧光显微镜下观察到明显的胞核定位，这与SRF的核转录因子的本质相吻合。本组实验选择病毒感染后7天为观察点，结果发现，与阴性对照病毒感染相比，过表达SRF-Full可明显促进外源性TGF-β1诱导的心肌细胞分化，表现为心肌细胞早期分化标志基因Nkx2.5和Gata4转录水平的增加，而晚期分化标志基因cTnI及平滑肌分化标记基因SM22α的转录水平未见增加；相反，SRF-N在一定程度上减弱了TGF-β1诱导的心肌细胞分化。由此可见，SRF-N具有拮抗干细胞成肌分化的作用。

考虑到人类慢性心衰心脏组织中SRF-N水平增加的事实，很可能心肌梗死或心衰患者其心脏组织中移植的干细胞由于SRF-N的存在干扰了移植干细胞的成肌分化，从而不利于移植干细胞生物学功能的发挥，今后我们将从体内研究来进一步验证这一假设。发现心肌梗死后有利或不利于移植干细胞生物学功能的因素并“扬长避短”，无疑对干细胞移植治疗缺血性心脏病具有重要的临床意义。总之，本组实验首次从体外实验角度证实SRF-N具有抑制CSC成肌分化的作用，为推进今后基于CSC移植治疗心肌梗死的临床转化医学提供新思路。

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ConstructionofthefulllengthandN-terminalfragmentofserumresponsefactorover-expressinglentiviralplasmidanditsimpactsoncardiacstemcelldifferentiation

LEI Hong1, WANG Ke-ke1, HA Yan-ping1, JIA Ya-nan2, LI Ru-jia1, SHEN Zhi-hua2, GUO Jun-li3, JIE Wei1

(1DepartmentofPathology,2DepartmentofPathophysiology,SchoolofBasicMedicineSciences,GuangdongMedicalUniversity,Zhanjiang524023,China;3CardiovascularInstitute,theFirstAffiliatedHospitalofHainanMedicalUniversity,Haikou570102,China)

PurposeTo analyze the effects of full length and N-terminal fragment of serum response factor (SRF-Full and SRF-N) on TGF-β1-induced differentiation in c-Kit+ cardiac stem cells (CSC).MethodsRat SRF-Full and SRF-N (1-254 aa) coding sequences were obtained from cDNA library and cloned into the linearized lentviral vector GV358 (Ubi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin) to generate the recombinant vectors, and then positive clones were selected and sequenced after transducing the competent cells with recombinant vectors. The recombinant lentvirus were packaged through transfecting the HEK293T cells with SRF-Full, SRF-N overexpressing plasmids and viral packaging plasmids. Neonatal SD rat c-Kit+ CSCs were isolated via magnetic activated cell sorting, and TGF-β1-induced differentiation in SRF-Full and SRF-N overexpression virus-infected CSCs was assessed by quantitative PCR.ResultsSRF-Full and SRF-N coding sequences were successfully obtained and properly cloned into the linearized GV358. The positive clones were selected and further confirmed by sequencing. With the help of packaging plasmids, the SRF-Full and SRF-N overexpressing plasmids-transfected HEK293T cells successfully produced the lentiviral particles with the titer of 2×108TU/mL, and the SRF-Full-Flag and SRF-N-Flag fusion protein were detected by Western blot in virus-infected HEK293T cells. Addition of TGF-β1 significantly induced up-regulated mRNAs in cardiomyocyte markers (Nkx2.5, Gata4, cTnI) and smooth muscle cell marker (SM22α) but not the epithelia cell marker (vWF) in CSCs. Overexpression of SRF-Full facilitated TGF-β1-triggered cardiomyocyte differentiation. However, SRF-N exerted anti-differentiation effects in TGF-β1-treated cells.ConclusionThe SRF-Full and SRF-N overexpressing recombinant lentiviral vectors are successfully constructed. SRF-Full facilitates while SRF-N suppresses TGF-β1-induced cardiomyocyte differentiation in c-Kit+ CSCs.

serum response factor; N-terminal fragment of serum response factor; plasmid construction; cardiac stem cell; cell differentiation

Q 21

A

1001-7399(2017)10-1109-07

时间：2017-10-23 13:30 网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20171023.1330.011.html

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.10.011

接受日期：2017-06-21

国家自然科学基金(81460042)、广东省教育厅科技创新项目基金(KJCX20130088)、广东省“扬帆计划”高层次人才项目(4YF16007G)、2015年国家留学人员科技活动择优资助项目

1广东医科大学基础医学院病理学系、2病理生理学教研室，湛江 524023

3海南医学院第一附属医院心血管研究所，海口 570102

雷 洪，女，硕士研究生。E-mail: 511622913@qq.com

揭 伟，男，博士，副教授，硕士生导师，通讯作者。Tel: (0759)2388584，E-mail: wei.jie@gdmc.edu.cn