ALK阳性非小细胞肺癌72例临床病理分析

曹培龙，王 凯，王鸿雁，张冠军，王春宝，蒋 娜，赵 荧

ALK阳性非小细胞肺癌72例临床病理分析

曹培龙，王 凯，王鸿雁，张冠军，王春宝，蒋 娜，赵 荧

目的探讨非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)伴间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase, ALK)蛋白阳性患者的临床病理学特征。方法应用Ventana抗ALK试剂和全自动免疫组化染色检测1 047例NSCLC组织中ALK的表达，并对其中142例进行RT-PCR检测。结果1 047例NSCLC中，共筛出72例ALK阳性，占(6.88%)；其中腺癌70例，腺鳞癌2例，男性40例，女性32例，中位年龄56岁，平均年龄55.60岁，37例有吸烟史，35例无吸烟史。组织形态学方面，43例以实性为主型，16例以腺泡样为主型，13例以乳头状为主型，无以附壁样为主型病例。结论ALK基因融合肺癌是NSCLC中的一种新的分子亚型，具有独特的临床表现和病理形态；Ventana抗ALK试剂和免疫组化染色是检测ALK阳性NSCLC的首选方法，对提高该类型肺癌的检出率及个体化治疗具有重要意义。

肺肿瘤；非小细胞肺癌；间变性淋巴瘤激酶；免疫组织化学

全球范围内肺癌的发病率和病死率均较高，其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)最为常见，约占肺癌的80%[1]。随着分子医学的进展和靶向药物的不断涌现，晚期NSCLC的治疗已进入到个体化治疗时代。目前以表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor, EGFR)基因突变为靶点的新型小分子酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors, TKIs)如吉非替尼、厄洛替尼等，在晚期NSCLC的治疗上，已取得较好的临床效果[2-3]。随之研究发现棘皮动物微管相关蛋白样4(echinoderm microtubule associated protein-like 4, EML4)与间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase, ALK)融合基因EML4-ALK是肺癌的驱动基因[4]。临床研究显示，ALK酪氨酸激酶抑制剂克唑替尼(crizotinib)对EML4-ALK融合基因阳性患者的疗效显著[3]，2011年美国食品药品管理局(FDA)和2013年我国食品药品监督管理局(CFDA)先后批准克唑替尼用于治疗局部晚期或转移性ALK阳性NSCLC患者。因此，通过晚期NSCLC患者ALK状态的检测，找出适合接受针对这一靶向治疗的患者已成为临床和病理医师的共同目标。本实验收集1 047例NSCLC样本，采用Ventana抗ALK试剂和全自动免疫组化染色，部分病例同时行RT-PCR检测，探讨其临床病理学特征。

1 材料与方法

1.1一般资料收集2012年4月～2015年12月西安交通大学第一附属医院存档的NSCLC石蜡包埋组织1 047份(鳞状细胞癌93例，腺癌952例，腺鳞癌2例)，其中包括手术切除肺叶、经皮肺穿刺、转移病灶的标本，获取其临床信息如年龄、性别、吸烟史、病理分型、原发部位、临床分期、EGFR基因突变检测结果等，通过电话随访患者本人或家属获取预后资料。

1.2方法

1.2.1标本处理 标本经10%中性福尔马林固定，脱水，石蜡包埋，4 μm厚切片，行HE染色。

1.2.2ALK蛋白免疫组化染色 ALK(D5F3)即用型兔单克隆抗体和OptiView DAB免疫组化检测试剂盒以及扩增试剂盒购自Roche Diagnostics GmbH公司，在Ventana BenchMark XT全自动免疫组化染色仪上进行检测，染色方法按Ventana全自动免疫组化染色仪操作流程进行(EnVision法)，均有阴性和阳性细胞系对照。采用二元判别法，即ALK阳性表达判断标准：无论着色细胞多少，只要有肿瘤细胞胞质内出现强染色颗粒，即判定为阳性[4]，反之为阴性。

1.2.3RT-PCR检测 采用Qiagen纯化试剂盒提取、纯化石蜡组织中的RNA，用人类EML4-ALK融合基因检测试剂盒(荧光PCR法，深圳艾德生物公司)，检测9种融合基因突变。

1.2.4EGFR基因突变检测 采用Qiagen DNA Kit石蜡包埋组织DNA提取试剂盒，抽提样本中的DNA；采用ARMS法检测EGFR基因的29种突变状态；操作严格按照试剂盒(深圳艾德生物公司)说明书进行。

1.3统计学分析采用SPSS 18.0软件进行统计学处理。组间率的比较用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1ALK阳性NSCLC的临床特征本组1 047例NSCLC组织中，共筛选出72例ALK阳性病例，检出率为6.88%。72例ALK阳性肺癌患者中，男性40例，占55.56%，女性32例，占44.44%，男性患者例数略多于女性。年龄25～85岁，中位年龄56岁，平均(55.60±11.49)岁。42例(58.30%)患者年龄<60岁，30例(41.60%)患者年龄≥60岁，在本组病例中年龄<60岁者数量多于年龄≥60岁者。其中年龄<60岁的女性有27例，占女性患者的64.28%(27/42)，男性15例，占男性患者的35.71%(15/42)，显示年龄<60岁ALK阳性的NSCLC患者中女性患者多于男性患者，差异有统计学意义(χ2=16.07，P<0.01)。本组72例肺癌患者，男性患者37例有吸烟史，仅3例无吸烟史，女性患者32例，均无吸烟史。发生于右肺者43例，占59.72%(43/72)，发生于左肺者29例，占40.28%(29/72)，右肺发病高于左肺。初发为转移病灶6例，占8.33%(6/72)，其中颈部淋巴结及纤维组织内转移5例，骨转移1例，后均被肺部活检证实，EGFR检测均为野生型，未行ALK融合基因检测。本组患者病理组织学分级：Ⅰ级1例，Ⅱ级17例，Ⅲ级54例；临床分期：Ⅰ期1例，Ⅱ期14例，Ⅲ期21例，Ⅳ期36例。提示ALK阳性NSCLC患者发现时大多病理组织学显示分化程度较低，且处于中、晚期的患者数量多。

2.2ALK阳性NSCLC的病理形态学特征本组72例NSCLC中腺癌70例，占97.22%，腺鳞癌2例，占2.78%，阳性部位为腺癌成分，无单纯鳞状细胞癌病例。其中41例以实性为主型，占58.57%(41/70)，癌细胞呈大小不等巢团状排列，大部分胞质较丰富，嗜酸性，类似鳞状细胞癌，但核膜薄、均一，细胞核染色质细或呈空泡状，可见明显核仁。本组中有20例呈现一种细胞黏附性差的改变，细胞呈多边形，胞质丰富细颗粒状或泡沫状，核居中或偏位似横纹肌样细胞(图1)。实性为主型中有7例合并黏液产生，3例以印戒细胞癌样为主。16例以腺泡样为主型，占22.86%(16/70)，表现为含大量腺体成分，细胞圆形或卵圆形，围绕中央空腔排列或呈筛状排列(图2)。腺泡样为主型中8例伴有明显黏液分泌。13例以乳头状为主型，占18.57%(13/70)，该型腺癌显示其主要成分为沿中心纤维血管轴心生长的腺癌细胞，部分区可出现附壁样生长，但肺泡腔内有乳头状结构(图3)，乳头为主型中有4例伴有黏液分泌。本组ALK阳性NSCLC患者中无以附壁样为主型病例，以实性为主型所占比例最大。三组不同组织形态学患者病死率之间差异无显著性(χ2=2.761，P>0.05)。

图1A.细胞多边形，胞质丰富细颗粒状或泡沫状，核居中或偏位似横纹肌样细胞；B.实性型非小细胞肺癌ALK阳性，EnVision法图2A.细胞圆形或卵圆形，围绕中央空腔排列或呈筛状排列；B.腺泡型非小细胞肺癌ALK阳性，EnVision法图3A.细胞沿中心纤维血管轴心生长，部分区可出现伏壁样生长，肺泡腔内有乳头状结构；B.乳头型非小细胞肺癌ALK阳性，EnVision法

2.3ALK阳性NSCLC的基因检测情况本组72例免疫组化染色ALK阳性病例中20例行RT-PCR检测9种EML4-ALK融合基因突变，结果突变率占95%(19/20)，1例未检测到突变。本组病例均行EGFR基因突变检测，其中4.17%(3/72)合并该基因突变(图4)，2例为19-del突变，组织学类型为腺泡型为主，1例为L858R突变，组织学类型为实体型，其余均为野生型。

EML4-ALK融合基因Exon-6、13、20融合突变，样本信号曲线有升起(呈S型曲线)表示该位点突变阳性

2.4ALK阳性NSCLC患者靶向治疗预后情况本组72例ALK阳性NSCLC患者随访3～56个月，截止随访结束，死亡37例，生存29例，6例失访。死亡患者确诊后生存时间最短1个月，最长34个月，平均生存时间(10.69±6.32)个月。获取随访资料而未用靶向药克唑替尼治疗的52例患者中34例死亡，占65.38%(34/52)，而使用克唑替尼治疗的14例患者中10例治疗后病情缓解或稳定，1例因肝损害治疗1个疗程后停药，病情进展，3例在服药9、27及32个月后死亡，病死率为21.4%(3/14)，平均生存时间为22.67个月，高于本组死亡患者的平均生存时间。这提示使用靶向药物(克唑替尼)治疗的患者预后好于未使用靶向治疗患者，两者差异有显著性(χ2=8.941，P<0.01，图5)。

3 讨论

自从2007年Soda等[5]和Rikova等[6]两个小组分别在NSCLC中发现EML4-ALK融合基因变异现象后，该基因便迅速成为肺癌分子靶向治疗领域的研究热点。2009年Shaw等[7]将ALK基因重排阳性的NSCLC定义为肺癌的一个新分子亚型，这被认为是近年来肺癌研究史上的一个里程碑式的事件。对于ALK融合基因在NSCLC的阳性率，不同人种和不同地区之间存在明显差异，总体来说，其阳性率范围为0.4%～11.6%，平均3.4%[5,8-9]，东亚地区中的日本、韩国和中国的阳性率分别为2.0%～6.7%、3.6%和2.9%～11.6%[9-11]，而高加索人的阳性率为0.4%～2.7%[8]。林小梅等[12]在对102例国人NSCLC患者的研究中发现EML4-ALK融合基因的阳性率为7.8%，本组中ALK融合基因的阳性率为6.88%(72/1 047)，与东亚人及我国的报道数据基本吻合。以往部分研究[7]认为EML4-ALK融合基因型者多为年轻男性、不吸烟或轻度吸烟的腺癌患者，但是也有一些独立研究结果显示在有吸烟史的患者也会观测到基因返转事件，并且认为吸烟状态的统计结果显示并非显著的辅助因素[5,7]。本组ALK阳性肺癌患者中，男性40例，占55.56%(40/72)，女性32例，占44.44%(32/72)，男性患者略多于女性，但是男性患者吸烟例数较多，占92.50%(37/40)，而女性患者均不吸烟，所以无法判断吸烟与ALK融合基因变异有关联。但是年龄<60岁的女性患者有27例，占女性患者的84.38%(27/32)，男性仅15例，占男性患者的37.5%(15/40)，所以在本组年龄<60岁的ALK阳性NSCLC患者中女性患者多于男性患者，差异有显著统计学意义(χ2=16.07，P<0.01)，与以往研究报道相符。本实验还发现发生于右肺者43例，占59.72%(43/72)，发生于左肺者29例，占40.28%(29/72)，因此推测，ALK融合基因阳性肺癌可能多见于右肺。2011年Yoshida等[13]在对EML4-ALK融合基因阳性肺癌的研究中发现，所有ALK阳性患者均存在局部腺癌成分，本组72例NSCLC中腺癌70例，占97.22%(70/72)，腺鳞癌2例，无单纯鳞状细胞癌病例，与其研究结果相似。未发现单纯鳞状细胞癌病例，可能与肺鳞状细胞癌EML4-ALK融合基因突变率极低，以及本实验未把所有鳞状细胞癌病例纳入检测有关，有待后续研究进一步证实。本实验通过对肺癌不同组织学类型的对比发现ALK阳性NSCLC患者中未发现以附壁样为主型病例，以实性为主型所占比例最大(占58.57%)，与文献[13-14]报道相符。作者发现在实性为主型腺癌中有20例呈现一种细胞黏附性差的改变，细胞呈多边形，胞质丰富，细颗粒状或泡沫状，核居中或偏位似横纹肌样细胞，这类癌细胞很少有黏液分泌，与印戒细胞癌不同，与其它类型肺癌对比有显著特征性，或许能成为ALK阳性NSCLC的一个组织学特征。本组有22例癌组织中有多少不等的黏液分泌，其中以印戒样癌细胞为主的病例3例，提示黏液分泌也是ALK阳性肺腺癌的一个特征，这与以往文献报道类似。值得注意的是这些有黏液分泌的癌组织均呈中度或低度分化，组织学以筛状和印戒状细胞为主，这也与Yoshida等[13]的发现一致，而有着明显黏液分泌的贴壁生长型腺癌(黏液性)(原来的黏液性BAC)，却未发现ALK融合基因突变。作者对20例免疫组化染色ALK阳性的肺癌标本行RT-PCR法检测9种EML4-ALK融合基因突变，结果突变率占95%(19/20)，仅1例未检测到突变。不同研究的特异性和敏感性在80%～100%和90%～100%[15-16]，本组实验结果与上述文献相符。这个结果显示ALK(D5F3)免疫组化染色方法简单易行，价格低廉，可以作为可靠的筛查手段。过去人们认为ALK融合基因与EGFR突变在NSCLC中相互排斥，但本组中37例患者同时采用ARMS法进行EGFR基因检测，结果发现3例患者共同存在EGFR突变和ALK基因融合，2例为19-del突变，组织学类型为腺泡型为主，1例为L858R突变，组织学类型为实体型，这3例患者同时也进行了ALK融合基因RT-PCR检测，均为阳性，证实是确切的EGFR、ALK双突变患者。近年来也有越来越多的研究发现EGFR与ALK双突变的人群，并且这些患者可能会对EGFR-TKI或ALK-TKI有不同程度的疗效[17]，本组3例术后给予易瑞沙治疗，目前分别随访10个月、11个月和13个月，患者病情稳定，以后是否进一步应用克唑替尼治疗还有待进一步随访证实。

图5靶向药物(克唑替尼)治疗对非小细胞肺癌患者预后的影响

克唑替尼治疗ALK阳性NSCLC患者客观有效率达60%，无进展生存期达8～10个月，总生存期显著延长[18]。本组14例ALK阳性NSCLC患者服用克唑替尼治疗，仅3例患者死亡，病死率为21.4%，明显低于未用克唑替尼组的病死率(65.38%)，平均生存时间22.67个月，明显高于本组死亡患者的平均生存期[(10.69±6.32)个月]，两组间差异也有显著统计学意义，所以本组实验也验证了克唑替尼对ALK阳性NSCLC患者作用显著，但是本实验使用克唑替尼治疗患者例数较少，还有待增加患者数量及随访时间进一步验证。

综上所述，本组实验显示ALK融合蛋白阳性的NSCLC多见于年龄小于60岁的患者，尤其是女性患者，数量明显多于男性患者。组织学类型中，以实性为主型腺癌所占比例最大，组织学分化较低，部分病例癌细胞黏附性差和有黏液分泌，中晚期患者较多，预后差。使用克唑替尼治疗，效果比较显著。通过ALK融合基因RT-PCR法进行验证，敏感性为100%，特异性为95%，因此认为Ventana抗ALK试剂和免疫组化染色是筛选ALK阳性NSCLC患者的一种非常有效的方法，对提高该类肺癌的检出率具有重要意义。

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Non-smallcelllungcancerwithEML4-ALKpositiveexpression:aclinicopathologicalanalysisof72cases

CAO Pei-long, WANG Kai, WANG Hong-yan, ZHANG Guan-jun, WANG Chun-bao, JIANG Na, ZHAO Ying

(DepartmentofPathology,theFirstAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity,Xi’an710061,China)

PurposeTo investigate the frequency of anaplastic lymphoma kinase (ALK) expression in non-small cell lung cancer (NSCLC) patients and its correlation with the clinicopathologic features.Methods1 047 cases of non-small cell lung cancer diagnosed by pathological examination were enrolled in this study. The status of ALK was detected by Ventana anti ALK reagent and IHC staining, and the clinical characteristics and pathological features of ALK gene were analyzed.ResultsAmong 1 047 patients with non-small cell lung cancer, there are 72 cases with positive ALK (6.88%). These cases included 70 cases of adenocrcinoms and 2 adenosquamous carcinomas, with 40 males and 32 females, or 37 smokers and 35 non-smokers. The median age was 56 years and the mean age was 55.60 years. Histopathologically, 43 cases were solid predominant adnocarcinomas, 16 cases were acinar predominant adenocarcinomas, and 13 cases were papillary predominant adenocarcinomas. None were lepidic predominant adenocarcinomas.ConclusionALK gene fusion lung cancer is a new molecular subtype of non-small cell lung cancer. It has unique clinical feature and pathological morphology. Ventana anti ALK reagent and IHC staining method are the first choice for the test of ALK positive non-small cell lung cancer, which has important significance to improve the detection rate and individual treatment for this type of lung cancer.

lung neoplasms; non-small cell lung cancer; anaplastic lymphoma kinase; immunohistochemistry

R 734.2

A

1001-7399(2017)10-1092-05

时间：2017-10-23 13:30 网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20171023.1330.007.html

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.10.007

接受日期：2017-08-30

西安交通大学第一附属医院病理科，西安 710061

曹培龙，男，硕士，主治医师。E-mail: cpl0208@163.com