超高效液相色谱串联质谱法同时检测干果中16种真菌毒素

王玉娇+聂继云+闫震+李志霞+程杨+张晓男

摘 要 建立了同时检测10种常见干果中16种真菌毒素的超高效液相色谱串联质谱方法。将干果可食部分加水匀浆，以10 mmol/L柠檬酸乙腈溶液为提取剂，C18为净化剂，使用ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱分离样品，在优化的洗脱梯度和时间条件下，16种真菌毒素在8 min内实现良好分离，检出限为0.02～1.00 μg/L； 在线性范围 （1～200 μg/L） 内线性相关系数R>0.9981，3个添加水平的平均回收率为70.48%～118.85%，相对标准偏差 （RSD） 为0.3%～11.9%。本方法经济、快速、简单、高效，能够满足不同干果基质中多种真菌毒素同时检测要求。

1 引 言

我国是干果第一生产大国，主产干果有核桃 （Walnut）、板栗 （Chinese chestnut）、榛子 （Hazelnut）、松子 （Pine nut）、杏仁 （Almond）、无花果干 （Dried fig）、桂圆干 （Dried longan）、红枣 （Chinese jujube）、葡萄干 （Raisin） 、柿饼 （Dried persimmon） 等。干果对人体生长发育、增强体质、预防疾病有极好的功效[1，2]。干果生长成熟期（果壳裂开）、采后处理（去壳、清洗等）及储藏过程中可能被产毒真菌侵染[3]。据欧盟食品和饲料快速预警体系 （The Rapid Alert System for Food and Feed， RASFF）的通报数据显示，2008～2014年，在被通报的26种食品安全风险因素中，真菌毒素通报数量始终在前三位，而坚果及其制品和种子类是被通报次数最多的食品种类[4，5]。在干果中检出的真菌毒素主要有黄曲霉毒素 （Aflatoxin， AFB1、AFB2、AFG1、AFG2）[6～8]、恩镰孢菌素 （Enniatine， ENA、ENA1、ENB、ENB1）[8]、白僵菌素 （Beauvericin， BEA）[8]、交链孢酚 （Alternariol， AOH）[8]、交链孢酚单甲醚（Alternariolmonomethyl ether， AME）[7]、腾毒素（Tentoxin， TEN）[8]、赭曲霉素（Ochratoxin， OTA、OTB）[8～11]、玉米赤霉烯酮（Zearalenone， ZEA）[10～12]、T2毒素[12，13]等16种。我国食品中真菌毒素限量标准（GB2761 2017）对4种毒素（AFB1、OTA、T2和ZEA）作出了限量标准，但只有AFB1的限量标准的适用范围包括干果产品，标准规定熟制坚果及籽类中AFB1含量低于5 μg/kg，杏仁、榛子中低于15 μg/kg[14，15]。

多种真菌毒素同时检测方法包括样品前处理和仪器分析两大步，其中以快速（Quick）、简单（Easy）、经济（Cheap）、高效（Effective）、稳定（Rugged）、安全（Safe）得名的QuEChERS前处理方法，具有仪器设备简单、处理步骤少、可实现多组分同时净化等优点，广泛用于真菌毒素检测[16，17]。本研究选择该样品前处理方法处理样品。常用的仪器分析方法有气相色谱（Gas chromatography， GC）[18]，液相色谱（Liquid chromatography， LC）[19，20]以及气相色谱串联质谱 （GCMS）[21]和液相色谱串联质谱法 （LCMS）[22，23]等，其中超高效液相色谱串联质谱（Ultra high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry， UPLCMS/MS）能满足多组分、高通量、快速定性和定量分析。

如今食品安全备受关注，而相关研究报道涵盖的干果基质和真菌毒素种类不全面，主要集中在核桃[6，9，12]、无花果干[9，12]、杏仁[10，11]中的黄曲霉毒素[6，9，11，12]、赭曲霉毒素[11～13]。如白春林等[6]对湖北省市售坚果及籽类中的黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2进行了检测分析，Trucksess等[9]对葡萄干、无花果中的AFB1、OTA进行了检测分析。现有的多種真菌毒素检测方法适用的基质一般为1～ 5种[10，11]，液相梯度洗脱时间在8 min以上[7，10，13]，如文献[13]和[29]中建立的检测方法分别在10 min内实现10种毒素和11种毒素的同时检测。本研究以我国主产的10种干果为基质，通过对比4种提取剂的提取效果。选择并优化净化剂用量和液相梯度洗脱条件，建立了干果中16种真菌毒素同时检测的超高效液相色谱串联质谱方法。

2 实验部分

2.1 仪器、试剂与材料

超高效液相色谱串联质谱仪（UPLCMS/MS Xevo TQ， 美国Waters公司）； CF16RXII立式大容量高速离心机（日本Hitachi公司）； MilliQDirecet 8全自动超纯水机（美国 Millipore 公司）； ACQUITY UPLC BEHC18色谱柱（100 mm × 2.1 mm， 1.7 μm， 美国 Waters 公司）； 九阳料理机（JYLC20， 中国九阳有限公司）。

甲醇、乙腈、乙酸铵、甲酸和柠檬酸（色谱纯，美国Thermo Fisher Scientific公司）； C18（50 μm， 6 nm）、 PSA （40 μm， 100 g） （美国Varian 公司）； 无水MgSO4 （优级纯，天津市津科精细化工研究所）； NaCl （优级纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）； 尼龙有机滤膜 （Nylon，美国FINE Scientific公司）； 黄曲霉毒素 （AFB1、AFB2、AFG1、AFG2）、赭曲霉素 （OTA、OTB）、玉米赤霉烯酮、T2毒素、恩镰孢菌素 （ENA、ENA1、ENB、ENB1）、白僵菌素、交链孢酚、交链孢酚单甲醚和腾毒素标准品（纯度≥98%，新加坡Pribolab公司）。endprint

2.2 标准溶液的配制

准确称取1 mg标准品，ENA、ENA1、ENB、ENB1和BEA标准品用甲醇溶解，其余毒素标准品用乙腈溶解，分别定容至5 mL，均配成200 mg/L的标准储备液； 准确吸取16种真菌毒素标准储备液各适量，以乙腈定容，得到10 mg/L的混合标准储备液，

用10 mmol/L柠檬酸乙腈溶液和空白基质溶液将混合标准液逐级稀释成200、 100、 50、 20、 10、 5.0、 2.0和1.0 μg/L的混合标准工作液。

2.3 样品前处理

取10种干果的可食部分100 g，按表1所示加水量匀浆处理； 准确称取一定量匀浆（表1）于50 mL离心管中，加入10 mL提取液，剧烈振荡3 min； 加入NaCl（1 g）和无水MgSO4（4 g），剧烈振荡1 min； 9000 r/min 离心5 min。吸取5 mL上清液于10 mL离心管，加入200 mg C18，涡旋1 min，静置40 min，过0.22 μm有机滤膜后，待测。

2.4 添加回收实验

以核桃空白基质为代表，添加100 μg/L的16种真菌毒素标准混合工作溶液，静置1 h，按2.3节所述方法进行前处理。

2.5 UPLCMS/MS条件

色谱条件： ACQUITY UPLC BEHC18色谱柱； 柱温： 40℃； 流动相A为乙腈，B为含0.5%甲酸的10 mmol/L乙酸铵溶液； 梯度洗脱程序： 0.0～1.0 min，5%A； 1.0～3.2 min，5%～50% A； 3.2～5.4 min，50%～95% A； 5.4～7.7 min，95% A； 7.7～8.0 min，95%～5% A。流速： 0.4 mL/min； 进样体积： 5 μL。

质谱参数： 电喷雾离子源（ESI）； 扫描方式： 正负同时扫描； 毛细管电压： 0.5 kV； 检测方式： 多反应监测（MRM）； 离子源温度： 150℃； 去溶剂气温度： 400℃； 去溶剂气： 氮气，800 L/h； 锥孔气： 氮气，50 L/h。其它参数见表2。

3 结果与讨论

3.1 提取剂的选择

如图1所示，参考文献[23]，通过添加回收实验对比了0.1%甲酸乙腈溶液（a，酸性）、乙腈（b，中性）、乙腈水甲酸（79∶20∶1，V/V）混合溶液（c，酸性极性）和 10 mmol/L

图1 16种真菌毒素经4种提取剂提取的回收率

Fig.1 Recoveries of 16 kinds of mycotoxins by four kinds of extracting agents

1： AFB1， 2： AFG1， 3： AFB2， 4： AFG2， 5： OTB， 6： OTA， 7： T2， 8： ENB， 9： ENB1， 10： ENA， 11： BEA， 12： AOH， 13： ZEA， 14： AME， 15： TEN， 16： ENA1. a， 0.1% formic acid （FA）acetonitrile （ACN）； b， ACN； c， ACNwaterTA （79∶20∶1， V/V）； d， 10 mmol/L citric acid in ACN.

柠檬酸乙腈溶液（d，酸性）4種提取剂的提取效果。其中c组回收率在120.75%～183.75%之间，不能满足检测要求； 其余3组回收率在76.15%～124.30%之间，利用统计分析软件SAS（STATISTICAL ANALYSIS SYSTEM）分析， b组和d组回收率方差呈现显著差异，且前者方差大于后者，说明10 mmol/L柠檬酸乙腈溶液提取的16种真菌毒素回收率更接近100%，因此弃用乙腈； 而a组和d组回收率方差无明显差异，考虑到柠檬酸比甲酸更经济环保，因此选取10 mmol/L柠檬酸乙腈溶液作为本研究方法的提取剂。

3.2 净化剂选择及用量

参考EN 15662[25]中的净化方法，首先考察PSA和C18对16种真菌毒素的吸附情况，结果见图2。OTB、OTA和AOH在3个PSA用量（低20 mg/mL、中50 mg/mL、高100 mg/mL）下的回收率都低于51.30%，表明PSA对OTB、OTA和AOH有强烈吸附； 而3个C18用量（低10 mg/mL、中30 mg/mL、高50 mg/mL）下16种真菌毒素平均回收率分别为90.58%、80.07%、76.43%，但C18用量为50 mg/mL时，BEA、ENA、ENA1、ENB和ENB1的回收率低于53.45%。采用50、100、150、200、300和450 mg C18添加量梯度做添加回收实验，计算样品基质溶液的基质效应（Matrix effect，ME（ME = B/A×100%，B为目标化合物在空白基质中的响应值，A为目标化合物在提取液中的响应值））[26]，通过回收率和基质效应评价净化效果[26]。由图3A可见，C18添加量为150、200、300和450 mg时，16种毒素的回收率在75.60%～111.8%之间； C18添加量为200 mg时的基质效应在57.55%～116.44%之间（图3B），利用SAS软件分析200 mg C18添加量与其它3种添加量（150、300和450 mg）的基质效应方差差异性，结果200 mg添加量的基质效应方差小于其它3种添加量且差异极显著，因此选择添加200 mg的C18进行净化。但葡萄干、红枣、柿饼等基质中的色素不能被去除，有待进一步优化。

3.3 梯度洗脱时间和条件优化

以乙腈（A）和含0.5%甲酸的10 mmol/L乙酸铵溶液（B）为流动相，分别在8、10和15 min内对16种真菌毒素总离子流进行监测，发现16种真菌毒素在8 min内完全出峰。考察了3个梯度洗脱条件（表3）的效果，结果在2.5节所述梯度洗脱条件（表3a）下，16种真菌毒素（浓度200 μg/L）峰形最佳且分离良好（图4）； 文献[13]和文献[28]中建立的检测方法分别在10 min内同时检测10种毒素和11种毒素，文献[29]建立的方法在7 min内同时检测14种毒素[13，27，29]，而本方法在8 min内实现了16种真菌毒素同时检测，与之前报道的同类方法相比，在更短的时间内实现了更多真菌毒素同时检测。endprint

3.4 线性范围及检出限

在2.5节所述条件下测定16种真菌毒素标准混合工作液，以峰面积对各真菌毒素进行线性回归分析，以核桃空白基质样品为基质，参考文献[30]利用低浓度添加回收（0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.00、2.00和5.00 μg/L）得出方法检出限和定量限。16种真菌毒素在1～200 μg/L范围内线性相关系数大于0.9981，检出限为0.02～1.00 μg/L，定量限为0.10～5.00 μg/L（表4），ENB、ENB1、ENA、ENA1、BEA的检出限与文献[8]一致，线性相关系数比文献[8]略高，而黄曲霉毒素（AFB1、AFB2、AFG1、AFG2）、赭曲霉毒素A、T2毒素和ZEA的检出限比文献[29]高，线性范围窄于该文献，但本研究同时检测的真菌毒素种类更多，适用的基质也更广泛。

3.5 回收率和精密度

用10种干果空白基质进行加标回收试验，对线性范围为1～20 μg/L的真菌毒素添加2、10和20 μg/L 的混合标准溶液，对线性范围在为5～200 μg/L的真菌毒素添加10、20和100 μg/L的混合标准溶液，每个水平进行6次平行实验，结果见表5。16种真菌毒素的平均回收率在70.48%～118.85%之间，RSD范围为0.3%～11.9%，能够满足10种干果基质中16种真菌毒素同时检测的需要，且以核桃基质为代表建立的前处理方法适用于其它9种基质。

3.6 实际样品分析

利用本方法对市售10种干果共30份样品（每种干果3份样品）进行检测。结果表明，17份（核桃2份，板栗2份，榛子1份，松子2份，杏仁1份，无花果3份，桂圆2份，红枣2份，柿饼2份）样品被检出含有真菌毒素。16种真菌毒素除了T2和BEA其它均有检出，其余14种真菌毒素检出值为黄曲霉毒素（AFB1、AFB2、AFG1、AFG2）