虫草素与羟丙基β环糊精的包合行为及性能研究

赵芳+赵雪秋+常清+王淑慧+杜瑶+杨丽娟

摘 要 通过饱和溶液方法制备了虫草素（COR）与羟丙基β环糊精（HPβCD）形成的包合物。采用紫外可见光谱法对水溶液中HPβCD与虫草素（COR）的包合行为进行研究，利用Job曲线法确定COR/HPβCD包合物的包合比，通过1H NMR和2D NMR、DSC、TG、XRD 、FTIR和SEM对COR/HPβCD包合物进行表征和性能测定。结果表明，COR/HP βCD包合物的包合比为1∶1，虫草素与HPβCD形成包合物后，其水溶性、热稳定性及生物环境稳定性都得到明显提高。COR/HPβCD包合物在医药领域具有潜在的应用前景。

1 引 言

虫草素（Cordycepin，COR，C10H13N5O3，结构如图1），又称虫草菌素、3脱氧腺苷，属于嘌呤类生物碱，是我国传统中药冬虫夏草的有效成分。虫草素最初从野生真菌中分离出来，是第一种天然核苷类抗菌素[1，2]。研究表明，虫草素具有抗肿瘤、抗真菌、抑制微生物生长、抗炎、降血糖、抗动脉粥样硬化等多种药用功效[3～6]。特别是对于白血病的治疗[7，8]，具有良好的临床应用前景。但是野生冬虫夏草的资源有限[9]，并且其药用有效成分虫草素的含量低，水溶性和生物利用度也低[9～11]，在体内不稳定、容易降解而失去活性[12]，导致其在药物制剂方面的应用受到限制[13]。目前，主要通过结构修饰[14～16]，或者与腺苷脱氨酶抑制剂联合应用[17，18]来改善虫草素的稳定性。但这些方法存在着制备困难[14]、选择性抑制大部分病毒[16]以及容易产生副作用[17]等问题。因此，研究有效的药物辅料以提高虫草素的稳定性、水溶性和生物利用度具有重要意义。

图1 虫草素（COR）的结构

Fig.1 Structure of cordycepin （COR）

环糊精（Cyclodextrin，CD）及其衍生物作为一种优良的脂溶性药物载体，一直以来都是研究热点。其中衍生物羟丙基β环糊精（Hydroxypropylβcyclodextrin，HPβCD）在药物、食品、化妆品等各个领域均被广泛的应用[1922]。主要是因为HPβCD的空腔大小适中，水溶性较好，在人体内的毒副作用小，原料便宜易得，且对提高药物溶解度及生物利用度有着显著的效果[19，23～25]。

在前期研究中，本课题组已成功应用环糊精的包合技术来改善黄酮类（橙皮素和山姜素）、木脂素类（鬼臼毒素）等天然药物分子的溶解度和稳定性[26～28]。结果表明，这些天然药物分子与HPβCD进行包合后，溶解度和稳定性得到明显改善。橙皮素、山姜素和鬼臼毒素的溶解度分别提高了411、15和28倍，其中鬼臼毒素本身的细胞毒活性在包合后没有受到影响。本实验对环糊精与虫草素的包合物进行了研究。虽然Zhang等[29]报道了αCD、βCD和γCD 3种环糊精与虫草素的包合研究，但HPβCD与虫草素的包合研究未见报道。本研究将着重探讨HPβCD与虫草素形成包合物的包合模式、包合物的表征及溶解效應，提供一种制备高溶解度和低毒的药物分子的新途径。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

Aglient 8453紫外可见分光光度计（美国Aglient公司）；STA449F3热重分析仪（德国耐驰公司）；Bruker Avance DRX500核磁共振仪（瑞士Bruker 公司）；转靶X射线衍射仪（日本理学公司TTR 18 kW铜靶）；Nicolet IS10 红外光谱仪（美国Thermo科技有限公司）。

COR（纯度>98%，宝鸡市晨光生物科技有限公司）；HPβCD（FW=1460.00，百灵威科技有限公司）。其它试剂均为分析纯，实验用水为超纯水。

2.2 COR/HPβCD包合物和物理混合物的制备

按摩尔比1∶1准确称取COR 5.0 mg，HPβCD 29.2 mg于50 mL圆底烧瓶，加入10 mL乙醇水混合液（1∶4，V/V），室温下避光搅拌14天，过滤除去不溶杂质，滤液再用0.45 μm微孔膜过滤，于50℃下减压蒸馏、真空干燥，即得白色固体包合物。

物理混合物则按摩尔比1∶1称取COR和HPβCD，使其充分混合即得。

2.3 Job曲线测定

COR/HPβCD包合物的化学计量比可以通过Job法[30]确定。采用pH=3.0的Na2HPO4柠檬酸缓冲液配制系列浓度的COR与HPβCD混合液，保持COR和HPβCD的总浓度为4.5×10mol/L，其中COR与HPβCD的摩尔比在0～1内变化[31，32]。 在其最大吸收波长258 nm处测定吸光度。

2.4 COR的标准曲线

用无水乙醇分别配制浓度为0.021、0.023、0.025、0.027、0.029、0.031、0.033和0.035 mol/L的COR溶液并测定其吸光度。然后在Origin 8.5软件中，以COR溶液的浓度C（mmol/L）为横坐标，吸光度A为纵坐标作图。标准曲线方程为A=25.80671C-0.14713，R2=0.99943（n=8）。

2.5 COR/HPβCD包合物的水溶性实验

通过制备饱和溶液的方法[33]测定COR/HPβCD包合物在水溶液中的溶解度。将过量的COR/HPβCD包合物投入2 mL水中（pH≈7.0），避光搅拌1 h，过滤后减压蒸馏得到白色固体。用乙醇稀释，在最大吸收波长下测定吸光度，根据COR的标准曲线计算包合物中COR的含量。

2.6 紫外可见光谱滴定实验

固定COR的浓度为0.02 mmol/L，按表1配制HPβCD的浓度，并分别采用Na2HPO4柠檬酸、NaHCO3无水Na2CO3和Na2HPO4NaH2PO4缓冲体系控制溶液的pH值为3.0、10.5和7.2，用乙醇水混合液（1∶4，V/V）和缓冲溶液定容，测定紫外可见吸收光谱。endprint

移取一定体积的COR溶液，加入适量环糊精， 于两个25 mL棕色容量瓶中，用乙醇水混合液（1∶4， V/V）和缓冲溶液定容，其中缓冲液为pH=1.5的KClHCl溶液。在37℃恒温水浴中放置1 h，于最大吸收波长下，每隔（12±2） h测定一次吸光度。所有实验平行测定3次。

3 结果与讨论

3.1 Job曲线

根据Job法绘制Job曲线（如图2所示），从曲线的最高点可以判断包合物的化学计量比。如果曲线的最高点为0.5，说明得到的包合物化学计量比为1∶1；如果最高点为0.67或0.75，则相对应的化学计量比为1∶2或1∶3。因此，从图3可以得出COR/HPβCD包合物的包合比为1∶1。

3.2 紫外可见光谱滴定

按照2.6节的方法，在200～800 nm下扫描紫外可见吸收光谱，得到COR/HPβCD包合物的紫外可见光谱滴定图（图3）。所有实验平行测定3次。

3.3 一维和二维核磁共振氢谱（1H NMR和2D NMR）

从图4可见，COR氢质子的化学位移δ在1.8～2.5 ppm、 4.2～4.5 ppm和5.5～8.5 ppm，可与环糊精的氢质子（δ 3.1～4.0和4.6～5.2）明显区分开来。通过计算COR的这些质子积分面积与HPβCD的H1积分面积，同样可以得到COR与HPβCD包合物的包合比为1∶1。图4 HPβCD（A）和COR/HPβCD包合物（B）在25℃下的1H NMR谱图（D2O，氘代水峰用星号标注）

3.4 热分析

由图7可见，COR（图7A）在228.5℃有一个尖锐的吸热峰，这是COR融化时的吸热峰，之后在278.0℃又出現一个吸热峰，该峰可能是COR的受热分解峰。HPβCD（图7B）在67.0℃处有一个非常宽大的吸热峰，这是HPβCD的脱水吸热过程。而从COR/HPβCD包合物的差热图（图7C）可发现2285℃和278.0℃这两个吸热峰消失了，说明作为自由态的COR已经不存在，同时HPβCD自身的宽大脱水吸热峰也变小了，这可能是因为COR进入HPβCD的空腔后，影响了水与HPβCD的结合。这也说明COR与HPβCD形成包合物后，热力学性质发生了改变。

3.5 XRD 粉末衍射

从图9可见，COR（图9A）呈晶型结构，HPβCD（图9B）呈无定形结构。而COR/HPβCD包合物（图9C）由部分晶型结构和无定形结构组成，但其晶型峰（2θ： 50～ 150）的位置较COR（图9A）的晶型峰发生向左偏移，峰的强度明显增强；同时其无定形结构部分（2θ： 150～ 350）与HPβCD（图9B）也有明显区别，这就说明形成的包合物具有新结构。

3.6 红外吸收光谱（FTIR）分析

由图10可见，COR/HPβCD包合物（图10C）的谱图中有一些很小的特征峰与 COR（图10A）和HPβCD（图10B）有细微区别，在2920、1680、1610和1200～1500 cm

3.7 扫描电子显微镜分析（SEM）

扫描电子显微镜常被用于物质表面结构的定性分析，从图11可见，COR呈棒状晶体（图11A），HPβCD是有空腔结构的球状晶体（图11B），COR/HPβCD的物理混合物有棒状和球状两种晶体结构存在，只是两种物质的相互混合（图11C）；而COR/HPβCD包合物则呈现出不规则的块状晶体，其形状结构发生了明显的变化（图11D）。说明COR和HPβCD形成包合物后，表面晶形结构发生了变化。

3.8 COR/HPβCD包合物水溶性分析

据文献[3，9～11]，COR的溶解度仅为4.3 mg/mL，按照2.5节的方法测定COR/HPβCD包合物的水溶性，经过计算得到其溶解度为170.5 mg/mL，表明COR与HPβCD形成包合物后，水溶性得到显著提高。

3.9 稳定性分析

为进一步对COR/HPβCD包合物的稳定性进行考察，以证明HPβCD作为COR载体的负载能力。按照2.7节的方法，在模拟人体的胃液环境（pH=1.5）下，测定了COR/HPβCD包合物的分解情况。从图12可见，COR溶液的紫外吸收值随着时间的增加而逐渐减弱，这表明在一定程度下COR会慢慢分解。而相比COR/HPβCD包合物来看，其在相同条件下吸光度变化较小，

这表明COR与HPβCD形成包合后，其稳定性得到提高。

4 结 论

本实验研究了虫草素（COR）与羟丙基β环糊精（HPβCD）之间形成的配位包合物的包合行为、包合物的制备及其结构表征，并测定了虫草素形成包合物后的水溶性和稳定性。研究表明， COR与HPβCD形成包合物的包合比为1∶1， HPβCD能显著地增加COR的水溶性和稳定性。COR形成包合物后，其溶解度从4.3 mg/mL提高到170.5 mg/mL，提高了39.6倍， 分解温度从200.0℃提高到261.0℃。这表明作为一种药物载体，HPβCD对改善COR的水溶性和稳定性起到了很大作用。此包合物制备方法简便易得、绿色环保，为虫草素在医药产品的设计上提供了较好的思路。endprint