基于离心式富集装置的酪氨酸磷酸肽分析新方法

孙婕+张万军+时照梅+秦伟捷 钱小红

摘 要 酪氨酸磷酸化及其相应激酶活性的研究在抗肿瘤药物靶点的研发中具有重要意义。由于酪氨酸磷酸化仅占蛋白质总磷酸化含量的不足0.1%，因此规模化的酪氨酸磷酸化鉴定面临着重大技术挑战。本研究构建了TiO2串联C18反相填料的离心式富集装置，结合抗体免疫沉淀法，建立了酪氨酸磷酸肽的富集策略。此新型富集装置由吸头、适配器和离心（EP）管组成，将TiO2富集磷酸肽和C18填料反相分离磷酸肽有机结合，以离心的方式进行样品的上样、清洗、洗脱和分离，再通过抗酪氨酸磷酸化抗体进一步特异性富集酪氨酸磷酸肽，从而实现了酪氨酸磷酸肽的高效富集和大规模质谱鉴定。通过离心式富集装置简化了实验步骤，减少了样品损失和人为因素干扰； 而且离心式、平行化的样品处理方式可显著提高分析通量。将此策略成功用于小鼠肝脏蛋白质酪氨酸磷酸化肽段的富集和质谱鉴定，在5 mg鼠肝蛋白中共鉴定出967个酪氨酸磷酸化位点，对应545个蛋白质，显示了其在蛋白质组学研究中的应用潜力。

1 引 言

激酶调控的蛋白质磷酸化修饰是最常见、最重要的蛋白质翻译后修饰之一，几乎参与调节生命活动的所有过程，包括细胞的增殖、发育和分化、细胞凋亡、神经活动和新陈代谢等[1～3]。其中，蛋白质酪氨酸磷酸化及相应激酶（Protein tyrosine kinase，PTK）是细胞信号转导过程中的关键因子，在细胞增殖、血管生成、细胞迁移、基因转录和代谢反应等调节机制中均发挥着重要作用[4]。PTK的活性异常会扰乱其下游的酪氨酸磷酸化修饰和相关信号通路，进而引起细胞信号调节紊乱，最终导致肿瘤形成[5]。已有研究表明，酪氨酸激酶的过度激活与肿瘤的发生、发展和预后均密切相关[6，7]。因此，以酪氨酸激酶为靶点的抗肿瘤药物研发是当前的研究热点。迄今为止，美国FDA批准上市的28种小分子激酶抑制剂靶向药物中，超过80%为酪氨酸激酶抑制剂[8]。因此，通过对蛋白质酪氨酸磷酸化的规模化研究，获得其对应激酶活性和相关信号通路的信息，对于抗肿瘤药物的研发与临床应用具有重要意义。

随着质谱技术的不断发展，基于质谱的蛋白质翻译后修饰的规模化鉴定也日臻成熟。但蛋白质酪氨酸磷酸化的质谱分析依然面临巨大挑战。在生物体内，酪氨酸磷酸化修饰含量极低（在磷酸化修饰中，S/T/Y的比例为1800∶200∶1[9]）。质谱鉴定时，大量非酪氨酸磷酸化肽段会对酪氨酸磷酸肽的信号造成干扰和抑制。因此，在分析复杂样本时，对酪氨酸磷酸肽进行选择性富集是质谱鉴定前样本处理的关键步骤。目前，应用于酪氨酸磷酸化修饰肽段的富集方法主要有免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）[10～13]、固相金属离子亲和色谱（Immobilized metal ion affinity chromatography，IMAC）[14，15]和金属氧化物亲和色谱（Metal oxide affinity chromatography，MOAC）[16～18]等。其中最常用的是抗体免疫沉淀富集。但实际样本高度的复杂性和抗酪氨酸磷酸化抗体有限的亲和力严重限制了富集的选择性和鉴定规模。MOAC常应用于磷酸肽的富集鉴定。其中，二氧化钛（TiO2）法因其操作简便、富集效果好、成本低，应用最为广泛。然而，该方法依然存在一些亟待解决的问题： 所需样品起始量大、实验步骤繁琐、极为费时费力、结果重现性较低、对酪氨酸磷酸肽无针对性富集、鉴定规模有限等。

针对上述问题，本研究构建了TiO2串联反相填料的离心式富集装置，结合抗体免疫沉淀，建立了蛋白质酪氨酸磷酸肽的富集策略。此策略首先通过新型富集装置将磷酸肽从复杂样品中富集出来，并将富集产物分离为不同馏分，大幅降低体系的复杂程度； 再通过抗体进一步特异性富集酪氨酸磷酸肽，从而实现酪氨酸磷酸肽的大规模质谱鉴定。不同于常规的磷酸肽富集方法，此新型富集装置通过自制的TiO2和反相填料装填小柱将磷酸肽的富集和反相分离有机结合，并以离心方式进行样品的上样、清洗、洗脱和分离， 不仅精简了实验步骤，减少了样品损失，而且降低了实验的劳动强度和人为因素干扰，非常适用于大规模、微量臨床样品的酪氨酸磷酸肽分析。将此策略应用于小鼠肝脏蛋白质的酪氨酸磷酸化规模化研究，共计富集鉴定酪氨酸磷酸肽849个，对应967个酪氨酸磷酸化位点和545个蛋白，为蛋白质酪氨酸磷酸化的生理功能研究和癌症治疗靶点筛选提供了技术支持。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

Orbitrap Fusion MS四极杆静电场轨道阱线性离子阱三合一组合式质谱、EasynLC 1000液相色谱、FRESCO 21高速离心机、RVT5105真空冷冻干燥机（美国Thermo Fisher Scientific公司）； BP211d分析天平（德国Sartorius公司）； SBH200D金属浴加热仪（英国Stuart公司）； JY92Ⅱ超声波细胞破碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司）； 纯水系统（美国Millipore公司）。

cOmpleteTablets蛋白酶抑制剂、PhosSTOP磷酸酶抑制剂（纯度99.9%， 德国Roche公司）； 测序级胰蛋白酶（Trypsin，纯度99.9%）、1，4二硫苏糖醇（DTT，纯度99%）及碘乙酰胺（IAA，纯度98%， 美国Promega公司）； 尿素（纯度99.0%）、色谱纯乙腈（ACN，纯度99.9%）、氨水（浓度61.7%， 美国SigmaAldrich公司）； 三氟乙酸（TFA，纯度99%，比利时Acros公司）； N2羟乙基哌嗪N2乙磺酸（HEPES，纯度99%，美国Amresco公司）； 二氧化钛颗粒（日本GL Sciences公司）； C8、C18膜（美国3M公司）； C18反相填料（粒径3 μm，Agela Technologies公司）； PTM703抗酪氨酸磷酸化抗体（杭州景杰生物科技有限公司）； PTyr100抗酪氨酸磷酸化抗体（美国Cell Signaling Technology公司）。endprint

2.2 小鼠肝脏蛋白质的提取和酶解处理

2.2.1 小鼠肝脏蛋白质提取 取10周龄SPF级C57BL/6小鼠的肝脏于离心管（EP管）中，加入配制好的尿素裂解液（9 mol/L尿素，20 mmol/L HEPES缓冲溶液，加入适量蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂），使用高通量组织研磨器破碎组织后， 将样品置于冰上，使用超声破碎仪进行蛋白质提取，取上清液，备用。

2.2.2 蛋白质酶解 取5 mg鼠肝蛋白，用尿素裂解液（9 mol/L 尿素，加入适量蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂）稀释1倍，在溶液中加入DTT（终浓度4.5 mmol/L），55℃金属浴孵育30 min。冰上冷却至室温后，加入10 mmol/L IAA充分混匀，室温避光静置30 min。用20 mmol/L HEPES缓冲液将所得蛋白溶液稀释4倍后，按胰蛋白酶和蛋白质1∶100 （m/m）加入胰蛋白酶，37℃酶解过夜后，使用SepPak C18柱将产物肽段脱盐，冻干。

2.3 磷酸肽富集与分离

2.3.1 TiO2填料装填富集吸头和C18反相填料装填分离吸头的制作 取200 μL移液器吸头，每只吸头装填4 mg TiO2填料和1层C8膜； 取10 μL超长吸头，装填3层C18膜、3 mg C18反相填料； 分别以200 μL乙腈和200 μL 15%氨水平衡富集和分离吸头。

2.3.2 磷酸肽的富集与分离 使用200 μL Binding 缓冲液（64% ACN+20%乳酸+ 4%TFA，V/V）溶解5 mg肽段，并转移至TiO2富集吸头中。将TiO2富集吸头固定在装有适配器的EP管中，500 g 离心。收集EP管中的流穿液，重复上样，共富集3次。采用200 μL Washing 缓冲液（80% ACN+5% TFA，V/V）清洗， 去除非磷酸肽，重复3次。将TiO2富集吸头插入C18分离吸头中，将二者串联结合，并固定于新的带有适配器的EP管。依次加入梯度洗脱液各200 μL： （1）15%浓氨水，500 g 离心； （2）2% ACN+98%（15%浓氨水），500 g 离心； （3）5% ACN+95%（15% 浓氨水），500 g 离心； （4）8% ACN+92%（15% 浓氨水），500g 离心； （5）10% ACN+90%（15% 浓氨水），500 g 离心； （6）40% ACN+60%（15% 浓氨水），500 g 离心。分别收集梯度洗脱的流穿液，两两合并： 2%+8% ACN、5%+10% ACN、0+40% ACN，冻干，

2.4 抗体富集酪氨酸磷酸化肽段 分别取两种固载抗酪氨酸磷酸化抗体的微球各15 μL，混合置于EP管中。将冻干的磷酸肽溶解于100 μL IP缓冲液（50 mmol/L TrisHCl，50 mmol/L NaCl， pH 6.9）中，与抗体微球混合后于4℃混悬过夜。之后使用300 μL IP缓冲液，反复清洗3次， 去除非酪氨酸磷酸肽。加入100 μL 0.15% （V/V） TFA洗脫所富集的酪氨酸磷酸肽，脱盐冻干后80℃保存。

2.5 质谱鉴定及数据处理

质谱条件： 正离子扫描模式； 电喷雾电压为2.2 kV，一级质谱分辨率为120000，一级AGC为5.0×105，最大离子注入时间为50 ms，全扫描质荷比范围为300～1400； 二级质谱母离子的选择采用数据依赖模式，HCD碰撞能量设定为32%，AGC为1.0e2，最大离子注入时间为250 ms，动态排除时间设为18 s，质谱采集时间为78 min。

数据检索条件： 采用Proteome Discoverer 1.4软件，以Mascot搜索引擎对数据进行检索，蛋白酶切类型选择Trypsin，允许最大肽段漏切位点数设为2，一级搜索质量偏差 ≤15 ppm， 二级搜索质量偏差≤0.5 Da，固定修饰为Carbamidomethyl（C），可变修饰为Oxidation（M）、 Acetyl（protein Nterm）、 Phosphorylation（ST）和Phosphorylation（Y）。肽段水平假阳性率（FDR）≤1%。

3 结果与讨论

3.1 磷酸化肽段的富集策略

复杂生物样本中蛋白质酪氨酸磷酸化的规模化鉴定是蛋白质组学研究的难点。常规的酪氨酸磷酸肽富集鉴定策略通常采用强阳离子交换色谱（SCX）将肽段样品分离为多个馏分，再对每个馏分分别进行磷酸肽富集和抗体免疫沉淀，最后进行质谱检测[19]。这种方法可显著降低样本的复杂性，提高富集效率； 但起始样本需求量大，步骤繁琐，且质谱检测耗时长。为了解决此问题，本研究构建了TiO2串联反相填料的富集装置，将磷酸肽的富集和分离有机结合，并通过离心的方式实现了简便、快捷、高通量的磷酸肽富集、洗脱和分离。此装置包括装填TiO2和C8膜的富集吸头，装填C18膜和C18反相填料的分离吸头，以及装有适配器的EP管收集器（图1A）。使用时，首先将肽段样品上样到固定于EP管收集器的富集吸头中（图1B），并清洗去除非磷酸肽； 再将富集吸头与分离吸头串联固定（图1C），将所富集的磷酸肽洗脱并保留在串联的分离吸头中； 最后采用不同乙腈含量的碱性洗脱液梯度洗脱，分离得到6个馏分，并交叉合并为3个馏分，分别进行质谱鉴定。此策略将经TiO2富集后，

图1 新型离心式磷酸肽富集与分离装置图。A 装置分解图； B 富集装置； C 分离装置

Fig.1 A new centrifugal device for phosphopeptides enrichment and separation： （A） An assembled view of the device， （B） enrichment device and （C） separation deviceendprint

氨水洗脱的磷酸肽直接串联高pH反相分离，从而将磷酸肽的富集与分离有机结合。避免了常用的SCX分离中，肽段脱盐和冻干等一系列繁琐的实验操作步骤和样本损失。同时，高pH反相分离与液相色谱质谱联用时使用的低pH反相分离具有良好的正交性，能够有效降低富集产物的复杂程度，提高磷酸肽的质谱鉴定效果[20]。采用此装置，以1 mg鼠肝蛋白为样品，在一次实验的3个馏分中分别鉴定到3269、2918和3217个磷酸肽（表1）。通过韦恩图（图2A）分析可知，77.7%的磷酸肽只在1个馏分中被鉴定到，说明了此装置可对磷酸肽高效富集分离。3个馏分共鉴定到10793个磷酸化位点，对应7333个非冗余磷酸肽。同样条件下，未经馏分分离而直接进行质谱鉴定， 只能得到3405个磷酸肽，富集选择性为74.0%，说明分馏策略可以在保证富集选择性的前提下显著提高磷酸肽的鉴定规模。将分馏后的馏分交叉合并，可将色谱保留行为差异较大的肽段混合，有效提高分馏与后续液相色谱质谱鉴定中色谱分离的正交性，比采用顺序合并更能使肽段均匀分布在整个色谱梯度洗脱的范围内，充分利用质谱的扫描时间，从而达到缩短质谱分析时间的目的[13，21，22]。使用此装置，3次重复实验分别鉴定到7333、7587和7962个磷酸化肽段，富集选择性为71.9%±2.4%。其中50.2%的磷酸肽至少在两次实验中被鉴定到（图2B）。此外，此富集分离装置与实验室常用离心机兼容性良好，通过离心式操作，可大大减轻实验者劳动强度，并可同时平行处理高达24个样品，显著提高了样品处理的通量。

3.2 小鼠肝脏蛋白质酪氨酸磷酸化修饰蛋白质组分析

在上述方法学研究的基础上，本研究对复杂的生物样本小鼠肝脏的蛋白质酪氨酸磷酸化修饰蛋白质组进行了分析。由于生物体内酪氨酸磷酸化肽段含量极低，其在TiO2富集产物中仍属于低丰度肽段，在质谱鉴定时易受到其它非酪氨酸磷酸肽的抑制，鉴定比例通常不超过总磷酸肽数量的1%。因此， 本研究对通过新型富集装置所得的总磷酸肽使用抗酪氨酸磷酸化抗体进行进一步的针对性富集，完整实验流程见图3。采用此新型富集分离策略，以5 mg鼠肝蛋白为样品，3次重复实验分别鉴定到482，429和564个酪氨酸磷酸肽，合计酪氨酸磷酸化位点达到967个，对应545个蛋白质。本研究同样以5 mg鼠肝蛋白为样品，单纯使用抗酪氨酸磷酸化抗体富集，经质谱鉴定得到酪氨酸磷酸化位点127个，对应106个蛋白质。与单纯使用抗酪氨酸磷酸化抗体富集的鉴定结果相比，修饰位点和蛋白质鉴定规模分别提高6倍和4倍。上述结果表明，此分析策略对于微量样本中蛋白质酪氨酸磷酸化富集鉴定的高效性。采用生物信息学工具DAVID数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）对鉴定到的545个酪氨酸磷酸化蛋白进行了GO注释分析[23]。通过对蛋白质的亚细胞定位进行分析可知，鉴定到的蛋白主要集中在外泌体、细胞液和细胞质中（图4A）。对蛋白质参与的生物学过程进行分析发现，鉴定到的酪氨酸磷酸化蛋白质主要参与细胞的代谢过程、氧化还原过程和磷酸化过程（图4B）。蛋白分子功能则主要包括细胞粘附、氧化还原和催化等（图4C）。上述分析与文献[4，5]报道的酪氨酸磷酸化蛋白的主要功能相符，验证了鉴定结果的可靠性。

4 结 论

本研究建立了一种可用于复杂样本中酪氨酸磷酸化修飾蛋白质的规模化鉴定的富集新策略。通过TiO2串联反相填料的新型离心式富集装置，将磷酸肽的富集和分离有机结合，实现了简便、快捷、平行化的磷酸肽富集和分离。在此基础上，采用抗酪氨酸磷酸化抗体对酪氨酸磷酸化肽段进行进一步针对性富集，结合质谱鉴定，成功实现了小鼠肝脏的酪氨酸磷酸化蛋白质组分析。实验结果表明，本研究建立的技术策略在翻译后修饰蛋白质组的高通量富集与鉴定研究中具有良好的应用潜力。endprint