质谱法分析大肠癌组织中亲核蛋白A的蛋白质变体

洪欣

摘 要 采用超滤、 亲和层析和双向电泳分离并纯化了人大肠癌组织中的亲核蛋白，结合蛋白印迹分析，发现亲核蛋白存在几个蛋白质变体的现象。采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱以及电喷雾串联质谱技术，对亲核蛋白的主要蛋白质变体的胰酶水解肽段进行了一级结构的解析， 发现大肠癌组织中的亲核蛋白主要存在N端乙酰化（Ac1Met及脱去N端甲硫氨酸后的Ac2Val）、 5Thr的磷酸化等修饰状态，这些修饰形式单独或者相互组合构成了亲核蛋白的主要蛋白质变体。此外，在亲核蛋白中还发现一些氧化修饰和脱氨基修饰的情况。研究表明，利用质谱及串联质谱技术，能够快速、 准确地鉴定人大肠癌组织中分离得到的亲核蛋白的几种蛋白质变体。

关键词 质谱； 亲核蛋白； 大肠癌； 乙酰化； 磷酸化

1 引 言

亲核蛋白在从细菌到人类的几乎所有生物体内普遍存在， 是具有多种生物学活性的蛋白质。其结构高度保守，属于具有催化含脯氨酸的寡肽底物順反异构作用的肽脯氨酰顺反异构酶（Peptidylprolyl cistrans isomerases， PPIase）。最初发现其能与一种免疫抑制剂环孢素A （Cyclosporin A， CsA）特异性结合， 故将其命名为亲环蛋白（Cyclophilin）。目前发现， 亲环蛋白家族成员广泛分布于细胞质基质和细胞核、 内质网、 线粒体及叶绿体等细胞器中。其中，人亲环蛋白A主要位于细胞质基质中，在抑制T细胞活化信号的传导、 肽基脯氨酸顺反异构酶活性、 蛋白折叠、 分子伴侣活性等方面具有重要作用。近来的研究表明，亲核蛋白A与多种类型恶性肿瘤的发生、 侵袭和转移密切相关[1]。例如，在手术切除后进行化疗的恶性卵巢癌患者组织中的亲核蛋白水平与后续化疗的疗效密切相关[2]。在肠型和弥散型胃腺癌患者组织中，亲核蛋白A的表达与正常胃粘膜组织相比呈明显上调趋势[3]。对结直肠癌患者手术切除组织的蛋白质组学研究结果显示，亲核蛋白A在肿瘤区域的表达水平明显高于正常癌旁组织[4]。将亲核蛋白A以及其它家族成员作为肿瘤治疗靶点已成为近年来的研究热点[5]。

蛋白质乙酰化是在乙酰基转移酶的作用下，在蛋白质N端α氨基或赖氨酸侧链ε氨基上共价结合乙酰基的过程，是细胞控制基因表达、 蛋白质活性或生理过程的一种重要机制[6]。与绝大多数蛋白类似，亲核蛋白能够被乙酰化修饰，从而影响其生物学功能。有研究表明，亲核蛋白A的乙酰化修饰能够促进其分泌，并且对于血管细胞的活化起着重要作用[7]。目前，关于亲核蛋白A在肿瘤研究领域的报道大多集中于亲核蛋白A在肿瘤组织中表达水平的变化，体现的是亲核蛋白A各个蛋白质变体的综合变化结果。而对于蛋白质变体类型， 特别是乙酰化修饰的蛋白质变体在肿瘤组织中的表达状态以及相应的分子机制方面的研究鲜见报道。因此，研究亲核蛋白A的乙酰化修饰，特别是肿瘤等病理条件下的亲核蛋白A的乙酰化状态，对于深入认识肿瘤的发病、 转移机理和研发新的抗肿瘤药物具有重要的指导作用。

现代质谱技术飞速发展，在生命科学领域得到了越来越广泛的应用[8～11]。应用质谱技术，不仅可以对蛋白质等生物大分子进行定性和定量的分析，还可对蛋白质的各种翻译后修饰进行精确的定位[12～14]，质谱技术已经逐步发展成为蛋白质翻译后修饰研究中最重要的分析手段。本研究采用超滤、 亲和层析和双向电泳分离并纯化人大肠癌组织中的亲核蛋白，采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDITOF）以及电喷雾（ESI）串联质谱技术，对初步分离纯化的亲核蛋白进行分析，鉴定了亲核蛋白中N端乙酰化、 5Thr的磷酸化等几种修饰状态。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

Autoflex MALDITOF质谱仪（德国Bruker Daltonics公司）； TripleTOF 5600质谱仪（美国Applied Biosystems公司）； 纳升高效液相色谱仪（美国Eksigent Technologies公司）； Optima L100K超速离心机（美国Beckman Coμlter公司）； PROTEAN i12等电聚焦电泳系统、 MiniPROTEAN Tetra Cell垂直电泳系统（美国BioRad公司）； C18毛细管色谱柱 （15 cm×75 μm，实验室自制）； Aurum AffiGel Blue Gel层析柱（美国BioRad公司）； 超滤离心管（MWCO 30 kDa，MWCO 3 kDa，美国Pall公司）； IPG预制胶条（7 cm，pH 3～10，美国BioRad公司）； BCA蛋白定量试剂盒（美国Pierce Chemicals公司）； 测序级TPCK修饰的胰蛋白酶（美国Promega公司）； a氰基4羟基肉桂酸（CHCA）＼， 尿素、 三羟甲基氨基甲烷（Tris）、 二硫苏糖醇（DTT）、 TFA、 碘乙酰胺（IAA）、 乙腈、 苯甲基磺酰氟（PMSF）等试剂均购自Sigma公司； 聚偏氟乙烯（PVDF）膜（美国Millipore公司）； 抗PPIA单克隆抗体（美国Santa Cruz公司）； 增强化学发光底物试剂（ECL Prime，美国GE Healthcare公司）； 其它试剂均为国产分析纯。实验用水为MilliQ纯水仪（美国Millipore公司）制备的超纯水。

2.2 亲核蛋白的分离纯化

大肠癌组织样本取自吉林大学中日联谊医院就诊并手术治疗的大肠癌患者。标本离体后，立即用生理盐水将血液冲净，加入少许液氮冷冻，再研磨成粉末状。加入10倍体积的含15 mmol/L TrisHCl（pH 7.2），0.5 mmol/L蛋白酶抑制剂Phenylmethanesulfonyl fluoride （PMSF） 的生理盐水，4℃下匀浆，以10000 g离心15 min，弃去沉淀。上清液于4℃， 以40000 r/min离心1 h，弃去沉淀。上清液用0.45 μm滤器过滤，滤液加到截留分子量为30 kDa的超滤离心管中，8000 g离心30 min，收集滤过液。将滤过液加到截留分子量为3 kDa的超滤离心管中，8000 g离心30 min，向浓缩的截留液中补充加入适量10 mmol/L KH2PO4缓冲液（pH 7.2），8000 g离心30 min，进行缓冲液替换，重复3次。收集浓缩截留液，在预先平衡好的Aurum AffiGel Blue Gel层析柱上样，依次用10 mmol/L KH2PO4缓冲液（pH 7.2）、 100 mmol/L KH2PO4缓冲液（pH 7.2）洗涤后，以300 mmol/L KH2PO4缓冲液（pH 7.2）洗脱，收集洗脱组分，用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度后，分装， 于 80℃保存。endprint

2.3 2二维电泳和蛋白印迹分析

取含10 μg蛋白的样品溶液，加入10倍体积的 20℃预冷丙酮，充分混匀， 20℃静置过夜。4℃下8000 g离心20 min，弃上清液。将蛋白沉淀溶解于水化上样缓冲液（8 mol/L 尿素，30 mmol/L TrisHCl，0.5% 两性电解质，微量溴酚兰），水化上样于pH 3～10的胶条（17 cm）后，进行等电聚焦电泳分离（60000 v.h）。将胶条依次用含有1% DTT和2.5% IAA的平衡母液（6 mol/L 尿素， 50 mmol/L TrisHCl，30% 甘油，2% SDS，微量溴酚兰）平衡后，转移至15% 的SDSPAGE凝胶顶部，用0.7% 低熔点琼脂糖进行封胶固定后，使用垂直电泳仪进行分离。电泳结束后，将凝胶上的蛋白电转移到PVDF膜上。清洗PVDF膜、 用BSA封闭后，与抗PPIA单克隆抗体在室温孵育2 h。将膜充分清洗后，再与HRP标记的兔抗鼠二抗在室温孵育2 h。将PVDF膜充分清洗后，利用增强化学发光（ECL）底物进行检测，使用凝胶成像仪记录蛋白印迹信号。相同条件下，重复进行一次二维电泳（2 DE）的分离，电泳结束后，胶片用考马斯亮蓝R250染色，然后用扫描仪进行扫描。

2.4 蛋白质样品的胶内酶解

参照以上蛋白印迹结果，将未转膜电泳凝胶上对应的亲环蛋白点取下，分别转移至新的微量离心管中。经脱色、 DTT还原和IAA烷基化，在37℃，用新配制的含测序级胰蛋白酶的50 mmol/L NH4HCO3溶液进行胶内水解16 h。加入少量 10%乙酸终止反应，上清液分装冻干后于 20℃保存。

2.5 质谱分析

2.5.1 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDITOF MS） 将冻干样品用基质溶液（50%ACN， 0.1% TFA， 10 mg/mL CHCA）溶解，取0.5 μL点样于样品靶上，室温自然干燥。利用Autoflex MALDITOF质谱仪进行检测。用肽段校正标准品（Angiotensin Ⅱ， AngiotensinⅠ， Substance P， Bombesin， ACTH clip 1～17， ACTH clip 18～39， Somatostatin 28）作外标，对质谱仪进行校正。采用阳离子反射模式，加速电压20 kV，延迟时间100 ns，激光频率20 Hz。每张谱图累积100次，每个样品采集3～5个谱图。

2.5.2 液相色譜串联质谱 （LCMS/MS） 样品用流动相A（水乙腈，99∶1，V/V，0.1%甲酸）溶解后，采用C18毛细管色谱柱 （15 cm×75 μm，实验室自制）进行分离。流动相B为乙腈水（99∶1，V/V，0.1%甲酸）。梯度洗脱条件： 0～60 min， 0～45% B； 60～61 min， 45% B； 61～62 min， 45%～90% B； 62～71 min， 90% B。利用TripleTOF 5600质谱仪对反相色谱洗脱出的肽段进行分析，质谱采集模式为信息依赖分析方式（Information dependent analysis， IDA）。纳升喷雾离子源的喷雾电压为2.4 kV，每个质谱采集循环包括一个全谱扫描和30个子离子扫描。全谱扫描范围m/z 350～1250，扫描时间为300 ms。每张串联谱的扫描范围m/z 100～1800，采集累积时间为100 ms，动态排除时间为15 s。

2.6 数据库检索

将所得LCMS/MS质谱原始数据文件（.wiff和.wiff.scan文件）用Protein Pilot 5.0（AB Sciex， USA）软件进行数据库检索，所用数据库为UniProt蛋白质数据库中的人种属（Homo sapiens）亚库。检索参数设置如下：胰蛋白酶切、 乙酰化强调和生物学修饰，假阳性率控制为1% FDR。

3 结果与讨论

3.1 大肠癌组织亲核蛋白同源异构体的分离及蛋白印迹分析

大肠癌组织手术标本离体后，迅速置于液氮中研磨成粉末状。加入抽提液后匀浆，超速离心得上清液。利用不同截留分子量的超滤离心管处理上清液，得到3～30 kDa蛋白组分。再利用装填有Cibacron Blue F3GA的Aurum AffiGel Blue Gel层析柱亲和纯化亲核蛋白。Cibacron Blue F3GA是一种活性色素，能够特异地结合一些蛋白，常被用作亲和纯化特殊蛋白，如各种细胞因子和一些酶类分子。2DE分离、 蛋白印迹分析（图1）结果表明，共有两个较明显的蛋白印迹点，其分子量基本相近（20 kDa附近）。对照蛋白印迹结果，找到了双向电泳凝胶上对应的蛋白点（P1，P2）。

3.2 亲核蛋白的质谱分析

将考染后的凝胶上与蛋白印迹上的亲核蛋白A显色信号对应的蛋白点（图1B中的P1、 P2点）取下，分别进行脱色、 胶内水解，得到酶解肽段。首先，利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪对样品进行测定，得到这两个蛋白点的肽指纹图谱（图2）。由图2可见，两个蛋白点的肽指纹图谱大致相似，说明很可能来源于同一蛋白而互为同源异构体，这与蛋白印迹的结果相互印证吻合。与亲核蛋白序列的理论酶切肽段的质荷比（m/z）对比，对一级质谱图中绝大多数分子离子峰进行了归属（表1）。

值得注意的是，图2的两个质谱图中除了大部分共有的相同多肽的分子离子峰，还存在一些有明显差异的信号峰，如图2A中的m/z 1987.9、 2118.8和2134.8，图2B中m/z 1732.9和1946.0。由表1可知，图2B中m/z 1946.0的峰归属为2VNPTVFFDIAVDGEPLGR19，图2A中的m/z 1987.9与1946.0相差41.9 Da，推测图2A中的m/z 1987.9很可能为2VNPTVFFDIAVDGEPLGR19的乙酰化修饰形式。利用液相色谱电喷雾串联质谱技术对来自P1和P2两个蛋白点的酶解样品进行了分析，在P1样品的质谱数据中找到m/z 994.5的双电荷分子离子峰（对应图2A中的m/z 1987.9）所产生的二级串联质谱图（图3A）。在P2样品的质谱数据中找到m/z 973.5的双电荷分子离子峰（对应为图2B中的m/z 1946.0）所产生的二级串联质谱图（图3B）。其中，图3B中的大多数碎片离子都归属为2VNPTVFFDIAVDGEPLGR19的b、 y系列离子。图3A中较多和3B中相同的碎片离子，也都归属为y系列碎片离子，如y1～y13。图3A中还有一系列碎片离子，分别比3B中b系列离子多42。因此，亲核蛋白P1切去N端甲硫氨酸后，在2Val的N端发生了乙酰化修饰； 亲核蛋白P2的N端则未发生乙酰化。除了以上带2个电荷的分子离子（m/z 994.5和973.5）外，还检测到了相对应的带3个电荷的分子离子峰（m/z 663.3和649.3），对其二级串联质谱数据的分析也证实了以上结论。此外，在图2B中有一个非常明显的m/z 1732.9的分子离子峰，而在图2A中没有或丰度很小。通过分析，推测为N端序列VNPTVFFDIAVDGEPLGR分子内断裂产物PTVFFDIAVDGEPLGR，它是由于质谱的源内裂解而产生的。endprint

此外，在P1樣品的二级质谱数据中， m/z 1060.0双电荷的分子离子峰（对应为图2A中m/z 2118.8）所产生的二级串联质谱图如图4A。对比图4A和图3，二者拥有许多相同的碎片离子，且都为y系列离子。这说明图4A所对应的肽段很有可能与图3的非常相似。经过进一步分析，推测其氨基酸序列应为Ac1MVNPTVFFDIAVDGEPLGR19，即N端甲硫氨酸未被切去且被乙酰化修饰。将图4A中m/z 130～300局部区间放大（图4B），可以更清楚地看到一些N端序列碎片离子。其中，m/z 174和273的碎片分别归属为b1和b2离子。因此，图2A中的m/z 2118.8离子被归属为Ac1MVNPTVFFDIAVDGEPLGR19。 m/z 2134.8与2118.8相差16 Da，其对应为相同多肽序列被氧化修饰的产物。

将LCMS/MS质谱数据进行数据库检索结果，与以上关于亲核蛋白N端乙酰化修饰的分析结果一致。通过数据库检索，在亲核蛋白P1的N端序列中还鉴定到一个磷酸化修饰位点5Thr（图5）。图5A是m/z 681.3的三电荷分子离子的串联质谱图，归属的肽段序列为1VNP*T*VFFDIAVDGEPLGR19（P*为氧化的Pro，T*为磷酸化的Thr）。检索软件基于Paragon算法给出的Peptide score为16，Peptide confidence为99。图5B则为m/z 725.0的三电荷分子离子的串联质谱图，归属的肽段序列也是5Thr 被磷酸化修饰的1MVNP*T*VFFDIAVDGEPLGR19。与图5A相比，差别在于N端的甲硫氨酸（1M）未被切除。检索软件基于Paragon算法给出的Peptide score为15，Peptide confidence值为99。尽管这两个磷酸化修饰肽段的信号强度并不高，但肽段检索的Peptide confidence值达到99，说明结果可信。在MALDI MS中没有检测到这两个磷酸化肽段的信号，这可能是由于多肽被磷酸化后，引入了负电荷，在正离子模式的MALDI MS中，其信号会显著减弱； 另外，在MALDI MS中，样品中所有多肽（磷酸化和未磷酸化的）同时在基质中被激光能量辅助离子化，带有负电荷的磷酸化肽段的离子化效率很低，这经常导致在MALDI MS中检测不到磷酸化多肽。

研究发现，大肠癌组织中的亲核蛋白存在蛋白变体形式（表2），这些蛋白变体在靠近蛋白质N端附近的序列存在至少6种不同的修饰类型。其中，在P1蛋白点中检测到了5种修饰类型，在P2蛋白点中只检测到1种。在P1和P2蛋白点中都未检测到N端甲硫氨酸（M）未切除且未被乙酰化修饰的肽段，即2MVNPTVFFDIAVDGEPLGR19。

4 结 论

采用超滤、 亲和层析分离纯化人大肠癌组织中的亲核蛋白，并通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱和电喷雾串联质谱对亲核蛋白胰酶水解肽段进行分析。结果表明，大肠癌组织中的亲核蛋白存在N端乙酰化（Ac1Met及脱去N端甲硫氨酸后的Ac2Val）、 5Thr的磷酸化、 4Pro的氧化等不同修饰状态，这些修饰形式单独或者相互组合，构成了亲核蛋白的主要蛋白变体。本方法为进一步研究不同病理进程的大肠癌组织中亲核蛋白不同蛋白变体的类型、 组成、 修饰状态与其生物学活性关系的研究提供了理论依据。

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Abstract Cyclophilin A was isolated from human colorectal carcinoma tissues by ultrafiltration， affinity chromatography， and two dimensional electrophoresis. By the aid of Western blot analysis， several isoforms of cyclophilin A were detected.， The tryptic digests from cyclophilin A were analyzed by matrixassisted laser desorption ionization timeofflight mass spectrometry as well as electrospray tandem mass spectrometry techniques. Several different modifications such as Nterminal acetylation （Ac1Met and Ac2Val） and phosphorylation of 5Thr were identified from these isoforms of cyclophilin A， which represented the majority of the proteoforms of cyclophilin A in this study. In addition， other kinds of modifications such as oxidation and deamidation were also found in these proteoforms. The results indicated that the developed method could be used to rapidly and correctly identify the several proteoforms of cyclophilin A isolated from human colorectal carcinoma tissues.

Keywords Mass spectrometry； Cyclophilin A； Colorectal carcinoma； Acetylation； Phosphorylation

（Received 6 November 2017； accepted 14 December 2017）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （No. 81572082） and the Jilin Province Science and Technology Department （Nos. 20150414015GH， 2011713）.endprint