核磁共振代谢组学方法研究雷公藤红素对大鼠糖尿病溃疡促愈合作用机制

胡永胜

摘 要 采用腹腔注射链脲佐菌素结合打孔器皮肤烫伤构建SD大鼠糖尿病溃疡模型，随机分为正常创面生理盐水处理组、 糖尿病溃疡模型生理盐水处理组、 糖尿病溃疡模型雷公藤红素处理组，溃疡创面持续给药处理14 d，利用基于核磁共振的代谢组学方法研究雷公藤红素处理后大鼠糖尿病溃疡组织代谢特征，并结合形态观察计算溃疡愈合率及组织病理学检测（HE染色、 Masson染色）技术研究大鼠糖尿病溃疡的愈合情况，揭示雷公藤红素对大鼠糖尿病溃疡的治疗作用及其机制。研究结果表明，雷公藤红素可诱导大鼠溃疡创面上皮再生化，调节炎性细胞浸润和胶原纤维分布，促进溃疡创面愈合。经偏最小二乘法分析，筛选并鉴定出20种潜在内源性差异代谢物。代谢通路分析表明，雷公藤红素能够显著提高溃疡组织三羧酸循环水平，促进其能量供应，加快蛋白合成，改善线粒体功能和氧化应激水平，加速皮肤组织的自我修复能力，促进糖尿病溃疡的愈合。本研究为雷公藤红素作为治疗糖尿病溃疡新药研究提供了参考。

关键词 雷公藤红素； 糖尿病溃疡； 核磁共振波谱； 代谢组学

1 引 言

糖尿病溃疡是糖尿病常见的慢性并发症之一，溃疡创面愈合延迟或不愈合、 愈合后创面反复发作，极易导致糖尿病患者致残和早亡[1]。糖尿病溃疡创面常伴随着炎症修复，然而过度炎症会影响创面肉芽形成，导致组织脆弱和上皮形成迟滞，最终加重溃疡创面难愈合和导致并发感染[2]，如何调控创面炎症修复已成为临床治疗糖尿病溃疡亟需解决的难点和重点问题[3，4]。

中药雷公藤中提取的活性成分雷公藤红素（Celastrol，Cel）具有抗肿瘤、 抑制免疫反应和抗炎症作用、 抑制血管生成等多种药理作用[5～7]，特别是优良的抗炎及调控成纤维细胞增生及胶原蛋白合成的药理作用[8，9]，在促进创面愈合方面显示了其潜在应用价值。然而雷公藤红素在治疗糖尿病溃疡方面的应用尚未见相关研究报道。

代谢组学重点关注生物体系受疾病侵袭、 药物干预、 环境变化等外界刺激下所产生的代谢应答变化规律，广泛应用于疾病诊断、 药物毒性评价、 作用机制和基因功能研究[10，11]。 与色谱质谱联用技术相比，核磁共振（NMR）技术具有非侵袭性、 非样品破坏性、 高分辨率和结果稳定、 重现性好的特点，在生物样本的微量检测和无损检测以及组织样本的原位检测方面是不可替代的分析手段[11，12]。鉴于此，本研究通过基于NMR的代谢组学技术和组织病理学检测技术，系统考察了雷公藤红素对糖尿病溃疡的治疗作用，并初步探讨其可能的作用机理，以期为雷公藤作为治疗糖尿病溃疡的新药研究提供实验依据。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

罗氏血糖仪（德国罗氏公司）； AL104电子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）； MilliQ 超纯水系统（美国Millipore公司）； Bruker AVANCE III 600 核磁共振谱仪（美国Bruker公司）； 5415R低温离心机（德国Eppendorf公司）； BX51 系统显微镜（Olympus公司）； SCIENTZ49高通量组织研磨器（宁波生物科技股份有限公司）。

雷公藤红素（批号CE150811，成都健腾生物技术有限公司）； 链脲佐菌素（Streptozocin， STZ，SigmaAldrich公司）； 柠檬酸、 柠檬酸钠、 水合氯醛（上海国药集团化学试剂有限公司）； D2O （99.9%氘代，剑桥同位素实验室）； HE染色试剂盒、 Masson染色试剂盒（南京凯基生物科技有限公司）。SD 雄性大鼠（体重180～220 g，上海斯莱克实验动物有限责任公司），实验动物许可证编号为 SCXK 20070005。

2.2 动物实验

2.2.1 糖尿病大鼠溃疡模型的制备 本研究经温州医科大学动物伦理委员会批准。SD雄性大鼠饲养在温州医科大学实验动物中心，单笼饲养，室温（22±3）℃，相对濕度50%±10%，12 h 交替照明，自由饮水、 进食。适应喂养7 d，随机抽取8只SD大鼠作为正常组，其余16只作为糖尿病造模组。过夜禁食13 h后，造模组注射新鲜配制的STZ 柠檬酸钠混悬溶液（60 mg/kg， i.p.），正常组给予同体积的柠檬酸钠混悬溶液（0.10 mol/L， pH 4.5），3 d后尾静脉采血测血糖，当血糖值大于16.7 mmol/L 且伴随出现“三多一少”症状者即为糖尿病造模成功[13]。再经过1周观测大鼠饮水饮食状况并记录血糖值后，进行糖尿病溃疡模型制作。

选取上述16只糖尿病大鼠，根据文献[14＼]报道的方法构建大鼠溃疡模型。即首先用10%水合氯醛腹腔麻醉后，背部剃毛，常规消毒，将打孔器（直径2 cm）置于沸水中煮5 min 后，用打孔器于大鼠背部脊柱两侧各停留30 s，造成二度烫伤，烫伤3 d后取下烫伤的皮肤，发现溃疡创面开始有肉芽组织生长，表明糖尿病溃疡模型制备成功。血糖水平正常的8只大鼠按上述方法制作正常创面组。

2.2.2 实验分组及给药实验 实验共分3组，每组8只大鼠：正常创面组（Con）、 糖尿病溃疡模型生理盐水处理组（DM）、 糖尿病溃疡模型雷公藤红素处理组（Cel），后两组为糖尿病溃疡造模成功的16只大鼠随机分组。单笼喂养， 每天固定时间给药1次，给药前用生理盐水清洗创面，其中Cel组喷洒雷公藤红素生理盐水溶液，给药剂量为500 μg/次，另外两组喷洒生理盐水，给药后无菌纱布覆盖创面。

2.3 皮肤愈合指标的测定

于创面给药处理后第4、 7、 9、 11和14 天分别对两组大鼠溃疡面照相，应用ImageTool 3.0 软件计算溃疡面积和愈合率。

2.4 大鼠皮肤溃疡面HE及Masson染色

大鼠创面给药处理后第14 d，分别取各处理组大鼠的溃疡皮肤组织，4%多聚甲醛固定24 h，不同浓度乙醇水溶液中进行脱水，二甲苯透明后常规石蜡包埋纵向连续切片（5 μm），进行HE及Masson染色，显微镜下检查创面组织的病理形态、 肉芽组织增生情况及上皮组织的形成。endprint

2.5 溃疡皮肤组织的1H NMR 檢测

大鼠创面给药处理后第14 d，分别取各处理组大鼠的溃疡组织，用分析天平称重并剪碎，所有组织的重量均值和标准差为（57.4 ± 15.7） mg，加入冰甲醇4 mL/g和蒸馏水0.85 mL/g 并采用SCIENTZ48高通量组织研磨器在低温环境下匀浆，涡旋混合样品15 s后，加入氯仿（2 mL/g）， 涡旋。最后加入冷的氯仿2 mL/g与蒸馏水溶液2 mL/g，混匀后于冰上静置15 min，1000 g离心15 min。待分层后取上层水溶液，冻干， 80℃保存，备用。

冻干粉用600 μL重水溶液充分溶解，1000 g离心10 min，取500 μL上清液转移至核磁管中。所有的1H NMR 实验均在Bruker AVANCE III 600M NMR 谱仪上进行，1H的共振频率为600.13 MHz。一维1H NMR 谱用90°的单脉冲序列， 预饱和方式压水峰，温度设定为298.0 K，谱宽12000 Hz，采样点数32000，累加次数为128 次。傅立叶变换之前，采集的FID 信号充零至64000，窗函数LB=0.3。所有的谱峰用Topspin 2.1软件进行相位校正和基线调整， 用乳酸的甲基峰（CH3， δ 1.33）进行定标。

2.6 NMR数据预处理和模式识别及统计学分析

为了发掘NMR 谱中包含的所有代谢物信息，以δ 0.004 为区间将1H NMR谱图（δ 9.996～0.496）划分为等宽的区域， 并对各个区域进行自动积分， 为了消除水峰，将δ 5.096～4.620 区域设为0，为了消除血糖的异常升高导致数据偏差，葡萄糖的谱峰信号也设为0 积分段。为了消除样本间的浓度差异，同时对每一谱峰进行归一化，最后将数据输入SIMCAP12.0 软件包（Umetrics， Ume， Sweden）进行偏最小二乘判别分析（PLSDA）。PLSDA 以第一和第二主成分（PC1 和PC2）作为x， y坐标轴构建二维空间（得分图， Scores plot），该空间中每一个点代表一例样本，图中椭圆内区域代表的是95%的置信区间。由PLSDA 得到的载荷图（Loading plot）上每一数值代表NMR 谱的一个积分区间，即对应某代谢物，此数值绝对值越大，对分组的贡献就越大。PLSDA分析的准确性和预测下用R2Y 和Q2的值表示。R2Y 表示PLSDA模型建模过程中所能解释的变量数据的比例； Q2表示模型所能预测的变量数据的比例，它们的大小直接反映了该模型的可靠程度（最大值为1）。

应用SPSS13.0 软件包进行统计学处理，结果以mean±SD表示，3组之间的比较采用方差分析检验，两组间比较采用独立样品t 检验，p<0.05 认为具有统计显著性差异。

3 结果与讨论

3.1 溃疡愈合情况及愈合率比较

在给药处理后的第4、 7、 9、 11和14 天对各实验组大鼠创面拍照分析表明，正常创面生理盐水处理组大鼠创面愈合明显快于另外两组，反映了高血糖水平具有延缓创面愈合作用； 糖尿病溃疡模型雷公藤红素处理组大鼠创面愈合明显快于糖尿病溃疡模型生理盐水处理组，雷公藤红素表现出对抗高血糖水平对创面愈合的延缓作用，可诱导上皮的再生化，加速糖尿病溃疡的创面愈合（见图1、 表1）。

3.2 HE和Masson染色结果

大鼠创面组织的HE和Masson染色结果表明，Con组、 DM组、 Cel组创面愈合情况有明显差异（图2）。HE染色图（图2A）显示，DM组相对于Con组和Cel组有更多、 更密集的炎性细胞，说明DM组的溃疡恢复能力较其它两组差。Cel组与DM组相比，表现为皮肤真皮层细胞数量少，且结节、 圆形和旋转的区域少，说明Cel组的溃疡恢复效果明显优于DM组（图2A）。在Masson染色结果中，除了能进一步清楚地看出各组细胞的数目和排列情况的差异，同时也发现DM组真皮层的胶原纤维更为浓密且分布不规整，这也说明其恢复程度不及Cel组（图2B）。

3.3 糖尿病溃疡组织的代谢轮廓分析

代谢组学以其多途径整体观的研究模式，在阐述药物的药理作用机制方面有着独特优势[15]。图3 显示了本研究中3组大鼠溃疡组织提取液的典型1D 1H NMR谱。图3中Con组列出了溃疡组织中能被1H NMR检测到的代谢物，相对于Con组，DM组和Cel组大鼠溃疡组织中的多种代谢物在给药处理14 d后都有明显的变化。为了深入挖掘NMR谱中包含的代谢信息，采用多变量模式识别方法对数据进行处理，PLSDA结果的散点图和载荷图见图4。3个实验组在散点图上明显分开，说明各组的代谢模式有较大差异，表明糖尿病影响创面愈合的代谢模式，雷公藤红素处理后在一定程度上逆转糖尿病对创面愈合代谢模式的改变。针对主成分得到的3组PLSDA模型的参数值列于表2， 3组建模的R2Y都很高，表明PLSDA模型可信。根据PLSDA模式识别分析，共筛选得到20种内源性代谢物的含量变化。

如表3所示，相对于Con组，DM组中的尿嘧啶、 S腺苷高半胱氨酸、 肌酸、 尿囊素、 谷氨酰胺、 谷氨酸、 酪氨酸、 甲酸、 丙氨酸、 三磷酸鸟苷、 胞苷、 肌苷的含量降低； 而尿刊酸酯、 α葡萄糖、 β葡萄糖、 醋酸、 磷酸胆碱、 牛磺酸、 肌醇、 丙酮酸的含量上升。与DM组相比，Cel组与DM组代谢物呈现了相似的代谢变化，如尿嘧啶、 S腺苷高半胱氨酸、 肌酸、 尿囊素、 谷氨酰胺、 谷氨酸、 酪氨酸、 甲酸、 丙氨酸、 三磷酸鸟苷、 胞苷、 肌苷的含量降低； α葡萄糖、 β葡萄糖、 磷酸胆碱、 牛磺酸、 肌醇的含量上升，这些代谢特征反映了高血糖水平对溃疡创面愈合的影响。然而更重要的是，这种代谢趋势得到了减缓甚至逆转，有趋向于Con组的代谢特征，在一定程度上反映了雷公藤红素对糖尿病溃疡的治疗作用。endprint

3.4 特征代谢物相关代谢通路及糖尿病溃疡的病理分子机制

基于1H NMR的代谢组学技术得到的代谢模式和代谢物变化，有助于了解雷公藤红素促进糖尿病溃疡创面愈合的作用机制。愈合率（Healing rate， HR）按下式计算：

HR（%）=[（OA-NHA）/OA＼]×100（1）

式中，OA为原始面积，NHA为未愈合面积。结果如表3和图5所示，与Con组相比，DM组和Cel组中葡萄糖都处于较高的水平， 提示雷公藤红素并不是通过降低血糖发挥减轻糖尿病溃疡的作用。糖尿病溃疡发生时，创面启动自我修复过程，此过程中涉及到氨基酸代谢、 蛋白质以及核酸物质的合成，需要保证充足的能量供应和物质代谢[16]。糖尿病大鼠高血糖引起的线粒体功能的改变、 能量代谢的失衡，呈现出能量供应效率降低； 此外， 参与体能氨基酸代谢、 蛋白质合成、 核酸代谢的相关代谢物水平下调，物质代谢储备不足，创面的自我修复过程受到影响。经雷公藤红素处理后，参与氨基酸代谢的S腺苷高半胱氨酸、 谷氨酸、 谷氨酰胺呈现了明显的回调趋势，提高了氨基酸代谢水平，保证了溃疡创面修复过程中蛋白合成需要。此外，参与核酸代谢的三磷酸鸟苷、 胞苷、 肌苷代谢水平也呈现了明显的回调，保证了創面自我修复过程中的核酸代谢需要。

丙酮酸含量的变化也值得注意，在DM组中，由于高血糖造成机体线粒体功能的改变，丙酮酸进入线粒体中进行有氧呼吸减少，造成了丙酮酸相对堆积[17]。经雷公藤红素处理后，丙酮酸含量恢复，提示雷公藤红素在一定程度上了改善了机体的线粒体功能，提高了能量供应的效率和能力[18]，改善了创面的愈合进程。此外，作为能量供应的补充，肌酸的储备也在雷公藤红素处理后呈回调趋势。此外，牛磺酸作为潜在的抗氧化剂， 可以保护组织免受氧化应激造成的损伤[19]，雷公藤红素处理后牛磺酸水平上调，提示该药可能通过抗氧化应激机制发挥促进糖尿病溃疡创面愈合的效应。

4 结 论

雷公藤红素可以调控糖尿病溃疡创面的炎性细胞聚集以及胶原纤维的分布，促进糖尿病溃疡创面的愈合，代谢组学结果初步提示该药可能通过促进蛋白质合成、 改善线粒体功能和氧化应激等机制发挥作用。本研究揭示了雷公藤红素可以作为治疗糖尿病溃疡新药开发的应用潜能，雷公藤红素对炎性细胞调控机制还有待于分子生物学和细胞生物学等技术进一步研究。

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Abstract The experimental SD rats were randomly divided into normal control group （Con group）， diabetic ulcer model group （DM group） and Celastrol group （Cel group）. Except the control group， diabetic ulceration rat models were established by intraperitoneal injection of streptozotocin along with skin scald. And then， each group was treated by spraying the saline solution on the affected skin with （Cel group） or without （Con group and DM group） Cel （q.d.×14 d）. Nuclear magnetic resonance （NMR）based metabonomic analysis was applied to detect metabolic characteristics， accompanied by healing rate calculation and HE and Masson staining to study therapeutic effect of celastrol on accelerated healing of skin wounds of diabetic ulceration rats， which could be used to elucidate therapeutic effects of celastrol on the rat diabetic ulceration and its mechanism. The results showed that celastrol could induce epithelial regeneration of the rat ulcer wound， regulate the infiltration of inflammatory cells and the distribution of collagen fibers， and promote the healing of the ulcer wound. About 20 endogenous potential differential metabolites were screened and identified by partial least square analysis. Metabolic pathway analysis was carried out to show that celastrol can significantly recovery the level of the tricarboxylic acid cycle， promote its energy supply， accelerate the protein synthesis， improve mitochondrial dysfunction and oxidative stress， and accelerate the selfrepair ability of skin tissue. Celastrol can promote the healing of ulcers skins of the diabetic rats， which contribute to experimental basis of the drugs for the treatment of diabetic ulcers.

Keywords Celastrol； Diabetic ulceration； Nuclear magnetic resonance； Metabolomics

（Received 22 June 2017； accepted 2 December 2017）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （No.81503335）and the Medical Science and Technology Innovation Foundation of Nanjing Military Region （No.14ZD13）endprint