地表水中的抗生素质谱指纹提取方法的研究

陈思祎

摘 要 从固相萃取柱、 上样样品pH值、 洗脱液、 定容液四方面优化前处理流程，建立了地表水中喹诺酮类、 磺胺类、 四环素类、 大环内酯类、 青霉素类、 头孢菌素类以及氨基糖苷类7类共49種抗生素的质谱指纹的提取方法。水样采用MAXHLB 串联柱富集净化，在超高效液相色谱串联质谱（UPLCMS /MS）的多反应监测（MRM）模式下进行定性及定量分析。结果表明，各抗生素在0.001～0.5 μg/mL （链霉素为0.01～5 μg/mL）浓度范围内线性关系良好，各目标抗生素的加标回收率为51.7%～94.8%，相对标准偏差为2.2%～9.7%。 以3倍和10倍信噪比确定目标抗生素在两种定容液中的检出限以及定量限分别为0.01～3.23 μg/L和0.05～3.43 μg/L以及0.04～10.8 μg/L和0.17～11.4 μg/L。应用此方法对秦淮河和玄武湖的9个位点进行了抗生素污染筛查。

关键词 固相萃取； 超高效液相色谱串联质谱； 抗生素； 地表水

1 引 言

近年来，抗生素水环境污染事件频发 [1]，引起环保部门以及社会各界的关注与重视，而抗生素全国使用量与排放量清单进一步揭示了我国抗生素的使用及污染现状[2]。目前已在我国多个水系的水体中检测到抗生素的存在[3]，浓度在ng/L～μg/L范围[1]。

在实际的地表水抗生素污染监控工作中，样品量巨大，污染对象也具有很大的不明确性，因此开发快速、 操作简便以及涵盖种类更广泛的抗生素质谱指纹提取方法将大大提高环保部门对水环境抗生素污染定位的能力，可及早发现污染、 追溯污染、 防止进一步造成严重的环境危害。所谓指纹，是指能够全面满足污染物证分析溯源需要的特征物质信息体系，该体系既要能够多层面广尺度展现污染源不同特性及其排它差异，又要能够通过灵敏快捷、 客观可靠的现代仪器联用技术测定[4]，而抗生素质谱指纹则是指通过质谱手段去获取的水环境抗生素信息。目前已有许多文献报道通过质谱手段同时检测多种抗生素的方法[5～8]。徐晖等[9]报道了一种检测河流水体中痕量的5类 12 种抗生素残留的固相萃取液相色谱串联质谱（SPELCMS/MS）方法，并应用该方法分析了河水中的抗生素残留； Julia等[10]开发了一种能够长期监测城市污水中医用抗生素的固相萃取液相色谱串联质谱（SPELCMS/MS）快速分析方法，该方法可以检测不同种类共18种抗生素。然而抗生素质谱指纹提取的主要目的是能够简便高效地提取多层面广尺度的抗生素信息，关键在于检测目标物的全面性。但是上述方法涵盖的抗生素种类有限，并且难以同时对一些理化性质差别巨大的不同类别抗生素进行检测，无法满足通过一次提取就能获得抗生素质谱指纹信息的需求。

本研究从固相萃取柱的选择、 上样样品pH值、 洗脱液、 定容液四方面对前处理流程的进行优化，建立了同时检测地表水中喹诺酮类（Quinolones， QLs）、 磺胺类（Sulfonamides， SAs）、 四环素类（Tetracyclines， TCs）、 大环内酯类（Macrolides， MLs）、 青霉素类（Penicillins， PENs）、 头孢菌素类（Cephalosporins， CEPs）以及链霉素（Streptomycin， STR）7类共49种抗生素指纹的固相萃取超高效液相色谱串联质谱（SPEUPLCMS/MS）的分析测定方法。应用本方法对秦淮河和玄武湖共9个位点进行抗生素污染筛查，定位地表水抗生素污染严重的异常位点。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

Agilent 1290 Infinity超高效液相色谱仪（美国Agilent 公司），配Agilent ECC18色谱柱（75 mm×2.1 mm， 2.7 μm）； SCIEX QTRAP 4500串联质谱仪（美国AB公司）； AG285电子天平（瑞士Mettler公司）； MG2200氮吹仪（日本EYELA公司）； WH3微型旋涡混合仪（上海楚定分析仪器有限公司）； MilliQ超纯水仪（美国Millipore公司）； 12通道固相萃取装置（美国Supelclean公司）。Waters Oasis WCX固相萃取柱（150 mg，6 mL）、 Waters Oasis HLB固相萃取柱（200 mg，6 mL）、 Waters Oasis MAX固相萃取柱（60 mg，3 mL，30 μm）购于美国Waters公司； CNW BOND SAX（200 mg，6mL，安谱公司）。

抗生素（如表1所示）标准品均购于德国Dr.Ehrenstorfer公司。抗生素内标均购自加拿大Toronto Research Chemicals公司。乙腈、 甲醇和甲酸（色谱纯，德国Merck公司）； 乙二胺四乙酸二钠 （Na2EDTA·2H2O ）、 NaOH（分析纯，南京化学试剂有限公司）。

将目标抗生素的标准品分别制成 1000 mg /L 标准储备液。其中，青霉素类抗生素用乙腈水（1∶1，V/V）配制，磺胺嘧啶和四种喹诺酮类抗生素标准储备液用1% （V/V）氨水甲醇配制，链霉素用20%（V/V）甲醇水溶液配制，其余目标抗生素用甲醇配制。

红霉素在酸性条件下会发生降解，实验中通过检测去水红霉素来实现对红霉素的监测。去水红霉素的配制方法：以30%甲醇溶液配制100 mg/L红霉素，用3 mol/L H2SO4调至pH 3，在室温下连续搅动3 h，使红霉素能完全转变为去水红霉素[11]。

2.2 样品的采集与保存

参照水质河流采样指导[12]，使用采水器采集采样点水面下0.5 m处的水样，每个采样点采集1 L的水样，采集到的水样用0.45 μm孔径的滤膜过滤后， 于4℃避光储存，并于一周内分析检测。endprint

2.3 样品前处理

取经过滤的水样1 L，加入0.8 g Na2EDTA和20 μL 内标（10 μg/mL的四环素d6、 磺胺二甲嘧啶d6），用8 mol/L NaOH调节至pH 11。固相萃取柱HLB和MAX分别用6 mL甲醇、 6 mL超纯水以及6 mL pH=11的超纯水活化。将两种固相萃取柱以MAX在上、 HLB在下的形式串联在一起，上样时水样先通过MAX柱再通过HLB柱。上样结束后，用6 mL 5%（V/V）氨水溶液淋洗MAX柱，用6 mL超纯水淋洗HLB柱，干燥。

MAX柱先用4.5 mL的溶液Ⅰ（甲酸（pH=3）甲醇（1∶9， V/V））溶液洗脱，并定容至5 mL，涡旋混合后过0.22 μm有机相滤膜，置于进样小瓶中，待分析检测。再用3 mL的甲醇和4 mL的2%甲酸甲醇溶液对MAX柱进行洗脱，洗脱液置于20 mL具塞比色管中。HLB柱用6 mL甲醇分3次洗脱，洗脱液置于同一比色管中。洗脱液在40℃下氮吹至完全干燥，用溶液Ⅱ（乙腈水（1∶9， V/V））定容至2 mL，涡旋2～3 min，18000 r/min离心10 min。取上清液过0.22 μm有机相滤膜，取其中1 mL加入甲酸至甲酸含量为0.2%，余下部分不添加甲酸，两份溶液待测。样品前处理流程如图1所示。

2.4 UPLCMS/MS条件

2.4.1 UPLC测定条件 柱温： 30℃， 流动相： 0.2%（V/V）甲酸/水（A）和乙腈（B），流速0.4 mL/min； 梯度洗脱程序： 0～7.00 min， 90%～60% A； 7.00～10.00 min， 60%～40% A； 10.00～10.01 min， 40%～90% A； 10.01～11.50 min， 90% A。

2.4.2 MS/MS条件 采用电喷雾离子源正电离模式（ESI+），多反应监测模式（MRM）。气帘气（Curtain gas，CUR）压力为35.0 kPa，喷雾气（Ion source gas 1，GS1）压力为55.0 kPa，辅助加热气（Ion source gas 2，GS2）压力为60.0 kPa，源温度（Temperature，TEM）为450.0℃，离子化电压（Ionspray Voltage， IS）为4500 V，碰撞气（Collision gas，CAD）參数为 Medium。其它参数如表1所示。

2.5 分析方法的质量控制

为保证实验结果的可靠性，实验中采用全程空白、 平行样及内标对分析过程进行质量控制，并采用标准添加法以降低基质效应的影响。本研究中，磺胺类抗生素以磺胺二甲嘧啶d6（SMTd6） 内标定量，四环素类抗生素以四环素d6（TCd6）内标定量； 其余抗生素，保留时间在2.5 min之前的以磺胺二甲嘧啶d6（SMTd6） 内标定量，在2.5 min后的以四环素d6（TCd6）内标定量。分别将2.3节中得到的3种水样提取液平均分成两份，一份直接进样分析，记录待测样品和内标的峰面积； 另一份根据第一份的检出情况，精密加入适量各目标物标准混合工作液，然后进样分析，记录待测样品和内标的峰面积。依据如下的标准添加法校正公式计算样品浓度：

C=SRxRs-Rx（1）

其中，C为校正后的浓度； S为标准添加量； RX为标准液添加前测得待测样品与内标峰面积比值； RS为标准液添加后测得待测样品与内标峰面积比值[13]。

3 结果与讨论

3.1 固相萃取柱的选择与串联

抗生素的净化富集多采用固相萃取的方法。比较了5种不同类型的固相萃取柱（反相吸附型HLB柱、 混合型阴离子交换型MAX柱、 混合型阳离子交换型MCX柱、 弱阳离子交换型WCX柱、 强阴离子交换型SAX柱）对目标抗生素的吸附效果（图2）。结果表明，大多数抗生素在使用MAX柱萃取时效果较好，回收率在60.2%～101.4%之间，但对磺胺类抗生素的富集效果不佳，这可能由于MAX柱一般在碱性条件下使用，此时两性的抗生素分子的羧基或者酚羟基等失去氢离子形成的阴离子可以与填料上的季铵阳离子结合，而磺胺类抗生素分子没有类似结构。相反，在酸性条件下使用MCX柱时，磺胺类抗生素结构中的氨基结合氢离子，形成阳离子，可与填料上的磺酸基阴离子结合，达到较好的富集效果。但MCX柱对喹诺酮类、 四环素类及链霉素3类抗生素富集效果极差，回收率低于40%。磺胺类和大环内酯类药物通过分子间作用力在HLB柱上有较好的富集效果。因此，考虑将MAX与HLB柱串联使用。

3.2 固相萃取的上样条件选择

HLB柱通常在酸性条件下使用，而MAX柱则多在碱性条件下上样，两者串联使用时需要将上样条件统一。综合考虑HLB柱和MAX柱的上样条件，选择MAX柱上样pH=3～4，HLB柱上样pH=8～9进行实验。

上样时的pH值与水样中抗生素的电离情况密切相关，在酸性上样条件下，两性分子多以阳离子的形式存在，在MAX柱上难以发生阴离子交换，因此对大多数的抗生素的萃取效果都不理想（图3），回收率均在20%以下。而HLB柱主要的作用原理是反相吸附，pH值对其的影响小于MAX柱，实验得到的回收率也相对较好，喹诺酮类、 大环内酯类及青霉素类的回收率在53.9%～81.1%，而回收率较低的磺胺类、 四环素类等目标物在两种柱子串联使用时回收率为52.2%～75.5%。综上，选择在碱性上样的条件下将MAX柱与HLB柱串联使用。

3.3 洗脱条件的选择

由于各类抗生素之间有较大的性质差异，单纯使用有机溶剂洗脱可能得不到较好的洗脱效果，实验中分别使用水系及有机系洗脱液对HLB和MAX柱进行洗脱（图4）。其中，水系洗脱液A（Eluent A）为甲酸（pH=3）甲醇（9∶1， V/V）混合溶液； 有机系洗脱液B（Eluent B）为甲醇（HLBB）及甲醇和甲酸甲醇（2∶98， V/V）（MAXB）。endprint

结果表明，磺胺类、 四环素类、 大环内酯类和青霉素类抗生素在HLB和MAX柱使用有机系的洗脱液时有较好的洗脱效果，喹诺酮和头孢类则在HLB柱使用有机系洗脱液洗脱时效果较好。MAX柱使用水系洗脱剂洗脱时相比HLB柱有较好的效果。链霉素在对两种柱子使用水系洗脱液时有较好的洗脱效果，并且MAX 柱的回收率（41.6%）大于HLB柱（15.6%）。综合考虑上述实验结果，采用对HLB柱使用甲醇洗脱，MAX柱用两种洗脱液分别洗脱以获得最佳实验结果。

3.4 定容液的比较

氮吹后使用定容液对残留物进行溶解定容，比较了两种定容液对实验结果的影响。

定容液A （Redissolve solution A）为乙腈0.2%甲酸溶液（1∶1， V/V）； 定容液B（Redissolve solution B）为乙腈0.2%甲酸溶液（1∶9， V/V）。结果如图5所示，使用定容液B的效果要优于A，尤其是四环素类抗生素，回收率明显增加。这是由于与定容液A相比，B的有机相比例较低，溶剂的极性较大，对一些极性较大的目标抗生素的溶解能力有所增加。

但是使用定容液B时也发现，青霉素类抗生素容易在检测谱图中出现双峰，不利于定量计算。这是由于青霉素类抗生素在酸性溶液中不稳定，易发生水解，生成青霉噻唑酸，例如苄青霉素（青霉素G）酸性条件下会发生降解，而 pH=5～9 时较为稳定[15]。采用定容液乙腈水（1∶9， V/V）时可以使谱图呈现单峰，故选择乙腈水（1∶9， V/V）作为定容液。将得到的样品分为两份，一部分以乙腈水（1∶9， V/V）作为定容液，检测青霉素； 另一部分以乙腈02%甲酸（1∶9， V/V）为定容液，检测其它抗生素。

3.5 方法学确证

3.5.1 线性范围及检出限 用各目标物的标准溶液配制系列浓度梯度（0.001～0.500 μg/mL，链霉素为0.01～5.00 μg/mL）的溶液，在上述UPLCMS/MS条件下进行检测，分别以3和10倍信噪比确定检出限和定量限（表2）。各目标物在此浓度范围内具有较好的线性关系，相关系数（R2）在0.9775～0.9994之间。

3.5.2 加标回收率 使用空白水样在两个添加水平（10和2 μg/L，链霉素为100和20 μg/L）下進行加标回收实验，结果表明，各目标抗生素的在两个浓度下的加标回收率为51.7%～94.8%，相对标准偏差（RSD）为2.2%～9.7%（表2）。目标物的质谱指纹图谱如图6所示。

3.6 实际样品检测

采用上述方法测定秦淮河（Q1～Q5）和玄武湖（X1～X4）的9个水样，检测结果如表3所示，样品中共检出15种抗生素，包括喹诺酮类、 磺胺类、 四环素类、 大环内酯类以及头孢类5类，抗生素含量分别为0.3～250.8 ng/L和1.3～210.2 ng/L。

其中，四环素类抗生素检出浓度最高，为70.6～250.8 ng/L，与Zou等[16]报道的检出浓度相近。四环素类抗生素多用于畜禽养殖。Zhang等[2]的调查研究显示，2013年在4种四环素类抗生素用量中，人用占24.8%，兽用占75.2%。四环素类抗生素也是江苏养殖场的常用药物，在动物粪便中有高的检出浓度和检出率[17]。因此，畜禽养殖污染可能是水样中四环素类抗生素的重要来源之一。

检出率较高的抗生素有林可霉素、 克林霉素、 红霉素以及头孢拉定，这4种抗生素最大浓度在25.3～0.3 ng/L之间。抗生素的高检出率可能与其使用量高或者生物降解性低等因素有关。头孢类抗生素是国内外临床应用最多的一类抗感染药物[18]，红霉素在养殖业以及疾病治疗中也有广泛应用。而林可霉素和克林霉素则由于具有胺、 环结构，脂族醚和硫结构，生物降解性低[19]，易残留在环境中。

Q3和X4位点的抗生素污染情况与其它位点有明显的差异，超过10种抗生素被检出，检出浓度高达540.8和412.7 ng/L。这一情况可能与位点附近存在抗生素的污染源有关，也可能与采样前的排污行为有关，因此需要对这两个位点进行密切监控。

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Abstract An extract method for the fingerprint feature of 49 kinds of antibiotics belonging to multiple classes in surface water was developed. Water sample was purified and concentrated by tandem dual column （MAX and HLB）， and qualitatively and quantitatively analyzed by ultrahigh performance liquid chromatographytandem mass spectrometric （SPEUPLCMS/MS） under multiple reaction monitoring （MRM） mode. The pretreatment was optimized in types of SPE column， loading pH， eluent and redissolution for multiclass antibiotics. The results showed that the linearity of target antibiotics was good in the range of 0.001-0.5 μg/mL （0.01-5 μg/mL for streptomycin）. The recoveries were from 51.7% to 94.8%， and the relative standard deviations （RSDs） ranged from 2.19% to 9.67%. The limits of detection （LOD， S/N=3） were 0.01-3.23 μg/L and 0.05-3.43 μg/L and the limits of quantification （LOQ， S/N=10） were 0.04-10.8 μg/L and 0.17-11.4 μg/L in different redissolve solutions. This method was applied to the determination of antibiotics in water samples from 9 sites of Qinhuai River and Xuanwu Lake.

Keywords Solid phase extraction； Ultra high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry； Antibiotic； Surface water

（Received 11 May 2017； accepted 1 November 2017）endprint