肿瘤靶向的磁性荧光IR780Fe3O4纳米颗粒用于循环肿瘤细胞的检测

孙枝红 周理华 邓冠军 郑明彬++言伟强++李文军 蔡林涛 龚萍

摘 要 循环肿瘤细胞（Circulating tumor cells，CTCs）的简单、快速分离和检测是目前临床研究中面临的一项挑战。本研究制备了具有肿瘤靶向识别作用的磁性荧光IR780Fe3O4纳米颗粒， 并将其用于CTCs的分离和检测。通过电镜、荧光光谱仪和超导量子干涉仪对合成的IR780Fe3O4纳米颗粒进行表征； 采用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪对IR780Fe3O4纳米颗粒对肿瘤细胞和正常细胞的靶向效果进行了分析； 利用激光共聚焦显微镜对IR780Fe3O4纳米颗粒在MCF7细胞中的位置进行定位； 并根据IR780Fe3O4纳米颗粒孵育后肿瘤细胞的荧光强度绘制标准曲线。研究结果表明，IR780Fe3O4能很好地靶向多种CTCs。细胞定位实验进一步表明，IR780Fe3O4主要靶向识别肿瘤细胞的线粒体。通过Fe3O4磁性纳米颗粒偶联IR780建立的这种方法可很好地区分肿瘤细胞和正常细胞，并对模拟血液中的CTCs进行了分离和检测。

1 引 言

肿瘤转移是导致肿瘤复发和难以根治的重要原因[1]。肿瘤的微转移（Micrometastasis）是指少数具有转移潜能的肿瘤细胞脱离原发灶，转移到血液、淋巴结、骨髓或远处器官中。目前临床上的检测方法很难发现这种微转移[2]。相关研究表明，在癌症发展的早期，已有微转移发生。循环肿瘤细胞（Circulating tumor cells，CTCs）是自发或因诊疗操作，由实体瘤或转移病灶释放进入外周血循环的肿瘤细胞，是恶性肿瘤患者出现术后复发或远处转移的重要标志。CTCs是公认的肿瘤转移的先导标志，其可作为肿瘤分期的重要判定标准[3]。此外，研究也表明， 肿瘤患者CTCs数据可作为肿瘤分期的重要预测因子和病情改善与否的标志[4]。CTCs的早期检测有助于早期发现肿瘤的微转移、监测术后复发、评估疗效及预后或选择合适的个体化治疗[5～7]。而且CTCs检测样本为血液，而血液标本易于收集且为微创性，因此即使是在无转移的情况下，CTCs也可作为潜在性实时标志物用于监测疾病进展和指导治疗方案的建立，预测治疗的有效性和必要性[8，9]。CTCs检测常见的检测方法有聚合酶链反应（PCR）、流式细胞分选（Fluorescenceactivated cell scanning/sorting， FACS）、免疫磁性分离（Magneticactivated cell separation， MACS）、稀有细胞自动检测系统，及基于表面拉曼增强（SERS）和量子点的方法[6，10～13]，基于纳米界面的捕获和分离方法近几年来也备受关注[14～16]。

尽管CTCs应用前景较好，但是在实际临床过程中应用程度则较低， 其原因主要有： （1）目前市场上尚无检测CTCs的完善的商业化系统； （2） 对于通过EpCAM检测CTCs的方式， 受到EpCAM表达的限制； （3）目前常用的检测方式过于繁琐，对操作水平要求过高并且所需成本亦较高。鉴于上述的不足，建立快速、简易、可准确检测CTCs并且将其有效分离的方法， 仍然是目前该领域所面临的一项挑战[10，11]。

纳米材料尤其是磁性纳米颗粒纳米材料已被广泛用于癌症的诊断和治疗。其中超顺磁性氧化铁纳米颗粒尤其是Fe3O4， 因其独特的磁特性和易于化学修饰而改善生物相容性备受关注[17，18]。Fe3O4纳米颗粒已广泛应用于生物固定、生物分离、环境处理、生物医药和医学工程、食品分析等方面[19～22]。此外，近红外染料逐渐被应用于肿瘤成像和靶向治疗方面，其穿透能力强，激发波长一般介于700～1000 nm之间，因此，在深部组织很容易检测到荧光强度[23～25]； IR780作为近红外染料中的一种， 具有很强的荧光强度和肿瘤靶向性， 可选择性地靶向输送至肿瘤的线粒体中， 常用于肿瘤成像和治疗[23～30]。Zhang等[31]探讨IR780靶向线粒体的机制，结果表明， 有机阴离子转运肽OATP1B3亚型在IR780靶向肿瘤细胞线粒体的过程中扮演着重要作用； Wang等[32]利用IR780靶向肿瘤细胞线粒体的特点，将其用于耐药性肺癌细胞的治疗，同常见化疗药物相比， 其可更好地靶向肿瘤细胞， 并且诱导肿瘤细胞的凋亡。

本研究建立了Fe3O4磁性纳米颗粒偶联IR780分离和检测CTCs的新的检测方法。利用IR780兼具较强的荧光强度和靶向肿瘤细胞的特点，通过荧光成像和流式细胞术评价检测方法的可行性，并建立了定量测定CTCs的方法，对其实用性进行了评价。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

FP6000荧光光谱仪（Jasco公司）； Leica TCS SP5激光共聚焦显微镜（德国莱卡公司）； NANO ZS多功能酶标仪（美国BioTek公司）； ViCELL XR全自动细胞计数仪（美国贝克曼库尔特公司）； Tecnai G2F20场发射透射电子显微镜（美国FEI公司）。DMEM培养基、胎牛血清（FBS）、链霉素、青霉素等购于美国Hyclone公司； Lysotracker Green、DAPI磁珠（Fe3O4纳米颗粒， 美国Thermo Fisher公司）。所用试剂均为分析纯

2.2 IR780Fe3O4纳米颗粒的制备

2.2.1 IR780NH（CH2）6NH2的合成 在5 ml无水DMF中加入6.97 mg己二胺2.1 μL三乙胺（TEA）， 氮气保护下，加入10 mg IR780，进行氯取代，室温下反应4 h。减压蒸馏除去DMF，用二氯甲烷/甲醇溶解， 层析过柱，得到绿色固体，产率为78%。

2.2.2 IR780Fe3O4的制备 将100 μL磁珠、 200 μL 0.4 mol/L NHS、 200 μL 0.4 mol/L EDC在DMF中活化3 h。 在氮气保护下，加入IR780NH（CH2）6NH2， 室溫反应过夜，反应液用水透析3天后，将透析好的纳米颗粒用截留分子量100 kDa 的超滤管超滤洗涤3次，即得到IR780Fe3O4纳米颗粒。endprint

2.3 IR780Fe3O4纳米颗粒的表征

采用透射电镜（ TEM）观察IR780Fe3O4纳米颗粒的形貌。取纯水溶液中的IR780Fe3O4纳米颗粒通过FP6000荧光光谱仪测定其荧光发射光谱； 采用VSM振动样品磁强计测定IR780Fe3O4纳米粒子的磁化曲线。

2.4 细胞培养

选择MCF7、bEnd3、A498、293、A549、HepG2、LO2、SKOV3和MCF10A（中国科学院细胞库）进行实验，其中MCF10A、LO2细胞系用RPMI1640完全培养基，其余细胞系均用DMEM完全培养基（10%小牛血清+1%的青霉素，链霉素）培养，置于5% CO2气氛中， 37℃恒温箱中培养。

2.5 激光共聚焦显微镜测定IR780Fe3O4的靶向效果

将处于对数生长期的MCF7、bEnd3细胞按照5000个/孔的浓度铺于8孔共聚焦平板中，放置于5% CO2， 37℃恒温箱中培养24 h后，更换培养基，每孔加入200 μL无血清的DMEM，同时加入5 μL浓度为2.5 μg/mL IR780Fe3O4纳米颗粒，孵育30 min后，PBS洗涤2次，加入DAPI染色液对细胞核染色和Lyso tracker Green对细胞溶酶体进行染色。15 min后，PBS洗涤两次，加入DMEM后用激光共聚焦显微镜对其进行成像及定位观察。

2.6 流式细胞仪检测肿瘤细胞和正常细胞对IR780Fe3O4纳米颗粒摄取

将处于对数生长期的肿瘤细胞（MCF7、A498、SKOV3和A549）和正常细胞（bEnd3、293、LO2、和MCF10A）按照5×104 cell/mL铺于培养皿中，放置于5% CO2， 37℃恒温箱培养过夜后，分别加入10 μL 2.5 μg/mL IR780Fe3O4纳米颗粒，孵育30 min，弃去培养基，0.25%胰酶消化，置于1.5 mL离心管，再用PBS离心洗2次，流式细胞仪测定肿瘤细胞和正常细胞对IR780Fe3O4纳米颗粒的摄取情况。

2.7 CTC检测标准曲线的建立及性能评价

将处于对数生长期的MCF7细胞按照5 × 104 cell/mL铺于培养皿中，置于5% CO2， 37℃恒温箱培养过夜后，加入10 μL IR780Fe3O4纳米颗粒至终浓度为2.5 μg/mL，孵育30 min，弃去培养基，0.25%胰酶消化，稀釋成不同的浓度（50、100、5×102、1×103、5×103、1×104、5×104、1×105 cell/mL），测定不同浓度下的荧光值，根据荧光测定值绘制标准曲线。

3 结果与讨论

3.1 IR780Fe3O4的合成及对肿瘤和正常细胞的靶向识别原理

IR780具有很强的荧光强度和肿瘤靶向性，并且其穿透能力强，在深部组织中也可检测到其荧光强度[33，34]。在所有类别的纳米颗粒中，超顺磁性氧化铁纳米颗粒，尤其是Fe3O4，因其独特的磁特性和易于化学修饰而改善生物相容性备受关注[17，18]。

IR780Fe3O4纳米颗粒的透射电镜（图1A）显示其颗粒大小均一，分散性好，呈经典的球形。通过动态光散射DLS粒度仪测得IR780Fe3O4纳米颗粒的平均水合粒径约为31.6 nm； IR780Fe3O4在不同pH值和不同NaCl浓度的稳定性如图1B所示，表明IR780Fe3O4在pH值介于5～9之间具有很好的稳定性，但是过高的离子浓度则破坏IR780Fe3O4的稳定性； 图1C为IR780的激发和发生光谱，在730 nm激发下，IR780Fe3O4纳米颗粒的发射峰在788 nm，具有较好的体内成像潜力[13，17]； 室温下测得IR780Fe3O4纳米粒子磁化曲线，其饱和磁强度为4.02 emu/g，如图1D所示，说明IR780Fe3O4纳米颗粒兼具Fe3O4的磁特性优势[18]，可用于肿瘤细胞的磁分离。

3.2 IR780Fe3O4对肿瘤细胞的靶向识别作用

激光共聚焦显微镜观察结果如图2所示， 视野中经IR780Fe3O4孵育后，在同样的参数条件下，MCF7细胞和bEnd3细胞相比呈现更强荧光强度，为进一步说明条件的一致性，将IR780Fe3O4孵育后MCF7和bEnd3细胞分别给予溶酶体探针标记，通过对比可更清晰地呈现出两种细胞之间的荧光差异性。此外，将MCF7和bEnd3细胞混合共培养，经IR780Fe3O4孵育，在同一视野下可清晰分辨出MCF7和bEnd3荧光差异性，同时也将其用溶酶体探针染色后，通过对比可显示出更明显荧光差异（图2）。

流式细胞仪分析IR780Fe3O4，孵育后肿瘤细胞（MCF7、A498、A549和SKOV3）和正常细胞（bEnd3、293、LO2和MCF10A）荧光强度的变化（图3），IR780Fe3O4孵育后，无论是肿瘤细胞，还是正常细胞，均较未孵育的细胞的荧光强度增加，但是孵育后肿瘤细胞的荧光强度均介于104～105，明显高于正常细胞的荧光强度（102～103）。

3.3 IR780Fe3O4纳米颗粒在细胞中的定位

图2和图3表明IR780Fe3O4可进入细胞。通过激光共聚焦显微镜观察IR780Fe3O4在细胞器中的具体分布情况（图4），将经2.5 μg/mL IR780Fe3O4孵育后的MCF7细胞，分别进行溶酶体和细胞核双染及线粒体和细胞核双染，在激发波长为405， 543和633 nm激光下观察IR780Fe3O4的分布情况，IR780Fe3O4位于细胞质中，并未进入细胞核内，其荧光与线粒体探针荧光基本上可以完全重合，表明IR780Fe3O4纳米颗粒可以进入细胞并且靶向于线粒体中，结果如图4所示，这与文献[31，32]一致，IR780可以靶向至肿瘤的线粒体中，可用于肿瘤荧光成像。

3.4 IR780Fe3O4应用于CTC检测

将IR780Fe3O4纳米颗粒孵育MCF7细胞，分别稀释成50、100、500、1×103、5×103、1×104、5×104和1×105 cell/mL，采用FP6000荧光光谱仪测定不同浓度下相应的荧光值，并且根据荧光测定值绘制标准曲线（图5）； 取IR780Fe3O4纳米颗粒孵育过，但细胞浓度未知的MCF7、A549、A498和SKOV3 细胞，按照1∶1， 1∶5和1∶25的比例稀释成3个梯度，每个梯度分别取3 mL（分装在3个离心管中，每管1 mL），其中管1通过测定荧光强度并根据荧光标准曲线计算细胞数量； 另外，管2应用磁分离技术将分离出的细胞分别用细胞板和细胞计数仪测定细胞数量，细胞计数仪和荧光法均具有较好依从性优于细胞板计数法，表明采用IR780Fe3O4检测CTC的标准曲线具有可行性（见表1和图5）。

为了进一步阐明IR780Fe3O4可有效地检测和分离肿瘤细胞和正常细胞，将1000 cell/mL MCF7分别与同浓度正常细胞bEnd3、293、LO2、和MCF10A

4 结 论

CTCs是循坏癌症极为重要的标志物，可作为患者预后判断的无创检测指标。本研究通过分析荧光强度变化，成功构建了CTCs检测体系。与其它方法相比，本方法制备简单、检测和分离方式快捷，可有效地用于检测肿瘤细胞。但是，CTCs因癌症种类不同而存在差异性，因此不能通过单一的检测方式就能够确定CTCs数量，进而评估患者疾病状态及其预后，而是应根据不同肿瘤细胞表面分子表达特点联合小分子荧光测定的优势，确定CTCs的数量，因此，后续的研究可在此基础上进一步完善，进而提高检测效率。endprint