超高效液相色谱串联质谱法测定环境样品中溴嘧氯草醚残留及其在土壤中降解特性的研究

何红梅+吴珉+张春荣+俞建忠+赵华+朱亚红+何开雨+张昌朋+蔡磊明+徐玲英+唐庆红

摘 要 建立了超高效液相色谱串联质谱法（UPLCMS/MS）测定土壤、沉积物和水中溴嘧氯草醚残留量的方法，研究了溴嘧氯草醚在3种不同类型土壤中的降解特性。样品经乙腈提取后，以C18固相萃取柱净化，采用梯度洗脱程序、BEH C18色谱分离柱、应用UPLCMS/MS多反应监测模式测定溴嘧氯草醚。对0.005、0.05 和2.0 mg/kg添加浓度样品进行回收实验，溴嘧氯草醚在土壤、沉积物和水中的平均回收率为87%～106%，变异系数为2.8%～8.0%。溴嘧氯草醚在0.5～20 μg/L浓度范围内相关系数R2>0.9999，溴嘧氯草醚在土壤（沉积物）和水中的定量限分别为0.2 μg/kg和0.2 μg/L。应用建立的溴嘧氯草醚残留分析方法检测了土壤降解样品，结果表明，溴嘧氯草醚在3种不同土壤中好氧降解的半衰期为1.72～28.2 d，厌氧降解的半衰期为2.93～31.4 d； 在同一种土壤样品中，好氧条件下溴嘧氯草醚降解快于厌氧条件； 土壤中溴嘧氯草醚降解的快慢与土壤的pH值、阳离子交换量和土壤质地有关。

1 引 言

2嘧啶氧基N芳基苄胺类衍生物是由中国科学院上海有机化学研究所和浙江省化工研究院有限公司共同发现的具有我国自主知识产权和高效除草活性的农药先导化合物[1]，并已获得多国专利授权[2]。基于该先导化合物， 研究者已开发出新型高效油菜田除草剂农药新品种：丙酯草醚和异丙酯草醚[3～8]。溴嘧氯草醚（开发代号：SIOC0426，化学名称為N[2氯6（4，6二甲氧基2嘧啶氧基）苄基]4溴苯胺，结构式见图1）是在对该先导化合物进行优化时发现的第一种除草活性高、杀草谱广、对棉花和棉田主要杂草有良好选择性的化合物，作为棉田除草剂候选品种具有良好的市场开发前景[2，9]。

图1 溴嘧氯草醚的结构式

Fig.1 Structure of SIOC0426 （ 4bromoN（ 2chloro6（ 4，6dimethoxypyrimidin2yloxy ）benzyl） aniline）

随着农药的广泛使用，农药与生态环境保护的矛盾日益突出，因此农药在环境中的残留分析方法以及其土壤降解特性研究对农药环境安全性评价具有重大意义。虽然溴嘧氯草醚具有低毒和无致突变特性[9]，但缺乏关于它的环境危害或风险研究。目前，未见溴嘧氯草醚在土壤中降解特性的报道，环境样品中溴嘧氯草醚残留分析方法也鲜有报道。本研究建立了超高效液相色谱串联质谱法检测土壤、沉积物和水中溴嘧氯草醚残留分析方法，为环境中该药物检测提供了参考方法； 同时，首次进行了溴嘧氯草醚在土壤上的降解特性研究，揭示了该药物在环境土壤中的降解特性，为该药物的环境安全性评价提供了参考资料。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

Waters ACQUITY 超高效液相色谱仪 和 Xevo TQ MS质谱仪（美国Waters公司）； 固相萃取仪（美国Supelco公司）； YP402N电子天平（上海精密科学仪器有限公司）； R201旋转蒸发器（上海申胜生物技术有限公司）； 循环水式多用真空泵（杭州大卫科教仪器有限公司）； HH4 恒温水浴锅和SHZ82型气浴恒温振荡器（江苏金坛亿通电子有限公司）。

乙腈和甲醇（色谱纯，美国Fisher公司）； 甲酸（色谱纯，Roe Scientific公司）； 纯净水（娃哈哈公司）； C18小柱（500 mg/6 mL，艾杰尔公司）； HLB固相萃取小柱（60 mg，美国Waters公司）； 酸性氧化铝（75～150 μm，层析用，上海五四化学试剂厂）； 玻璃层析柱（25 cm×0.1 cm）。99.9%的溴嘧氯草醚标准品和原药均由中国科学院上海有机化学研究所提供。其它试剂均为分析纯。

土壤A/B/C分别采自浙江金华、浙江余杭和浙江萧山地区的3种有代表性且不同性质的土壤，沉积物和水采自浙江西湖代表性水域。

2.2 标准溶液配制及原药溶液配制

准确称取适量标样，用乙腈配制药物标准储备液，4℃保存。将标准储备液稀释成0.0005、0.001、0.002、0.005、0.01和0.02 mg/L系列标准工作溶液，现配现用。

准确称取适量原药，用乙腈定容，配制1000 mg/L溴嘧氯草醚原药母液。

2.3 样品提取与净化

2.3.1 提取 沉积物（土壤）：称取20 g样品至三角瓶中，加入5 mL 水和40 mL乙腈，振荡30 min，抽滤，转出滤液至装有10 g NaCl的具塞量筒，在滤渣中再加入40 mL乙腈，振荡30 min，抽滤，合并滤液，剧烈振摇具塞量筒2 min后静置2 h，吸取10 mL乙腈于40℃浓缩至近干，待过柱。水样则直接转移过柱。

2.3.2 净化 用甲醇5 mL、水5 mL预淋固相萃取柱，用20%乙腈5.0 mL溶解残渣上样（或直接移取2 mL水样过柱），再用乙腈水（50%， V/V） 3 mL淋洗小柱并弃去，最后用5.0 mL 乙腈洗脱并收集， 过0.22 μm膜， 待进样。

2.4 土壤降解实验

2.4.1 土壤样品预处理 选取不同类型的土壤研究溴嘧氯草醚的土壤降解特性，3种不同土壤性质见表1。称取20 g土壤（精确至0.01 g）置于250 mL培养瓶中，每种土壤各称取多份，加水至土壤的40%饱和持水量，塞上有砂芯透气的硅胶塞预培养2周。

2.4.2 土壤加药 加药前先补水至土壤的40%饱和持水量，再在每个培养瓶中加入0.02 mL 1000 mg/L溴嘧氯草醚母液，混匀土壤样品，溴嘧氯草醚在土壤中的初始理论浓度为1.0 mg/kg。

2.4.3 土壤培养 （1）好氧培养 每个培养瓶加药后，加水至60%饱和持水量混匀，塞上透气的硅胶塞，置于（25±1）℃黑暗的恒温箱中培养。（2）厌氧培养每个培养瓶加药后，加水至土壤表面有1 cm水层，塞上透气的硅胶塞，置于（25±1）℃黑暗的恒温箱中培养。endprint

2.4.4 培养土取样 （1）土壤A取样 于培养后的0、0.75、3、4.75、6、7、9、15和34 d取样，每种土壤每次取出2个培养瓶， 测定土壤中溴嘧氯草醚残留量。（2）土壤B和土壤C取样 于培养后的0、10、20、30、40、50、60、72、80、100和120 d取样，每种土壤每次取出2个培养瓶测定土壤中溴嘧氯草醚残留量。

2.5 色谱质谱条件

色谱柱： ACQUITY UPLCTM BEH C18 （50 mm ×2.1 mm i.d.， 1.7 μm）。 流动相： 梯度洗脱， A相为乙腈、 B相为0.1%甲酸溶液， 梯度洗脱： 0～1 min， 50%～90% A； 1～3.5 min， 90% A； 3.5～4.0 min， 50% A； 4～5 min， 50% A。 流速： 0.2 mL/min。 柱温： 40℃。 进样体积： 2 μL。

质谱仪器条件： 毛细管电压为3.0 kV（ESI+）、脱溶剂温度为400℃、脱溶剂气流速为800 L/h。一级锥孔电压为22 V， 溴嘧氯草醚的定性与定量（*）离子对分别为m/z 451.9/281， m/z 451.9/279（*）、碰撞能量均为20 eV。

3 结果与讨论

3.1 色谱、质谱条件优化

实验选择C18色谱柱、乙腈和0.1%甲酸为流动相，采用了梯度洗脱程序，首先采用ESI+的全扫描模式对溴嘧氯草醚进行分子离子峰的确认。由于溴嘧氯草醚含有1个氯原子和1个溴原子，利用热电公司Xalibur软件计算溴嘧氯草醚（C19H17O3 N3ClBr）的理论质荷比（m/z）分別为：451（100%）、449（75.7%）、453（26.4%）、452（21.7%）、450（16.6%）、454（5.5%）。ESI+的全扫描模式发现溴嘧氯草醚的同位素峰很明显，分子离子峰（[M+H]+）分别可见m/z 452、450、454、453、451和455（见图2）。

的全扫描模式未发现溴嘧氯草醚明显分子离子峰，故确定扫描模式为ESI+，分子离子峰为m/z 452，再通过子离子扫描模式确定了溴嘧氯草醚的两个主要子离子，分别为m/z 279和281。逐步优化毛细管电压、锥孔电压和碰撞能量等参数，获得了测定溴嘧氯草醚的最佳质谱条件。

实验表明，溴嘧氯草醚在C18色谱柱上保留较强，无需使用特殊色谱柱进行分析，而且在流动相的水相添加0.1%甲酸时溴嘧氯草醚响应值较高，含盐流动相对其响应值并未明显增加，采用梯度洗脱能获得更好的峰响应和峰型，故在实验中采用了乙腈和0.1%甲酸作为流动相的梯度洗脱程序。

3.2 净化方法的确定

考察了药物在C18固相萃取小柱和酸性氧化铝柱上的保留情况：（1）考察了在丙酮/石油醚体系和乙腈水体系下酸性氧化铝柱填料对溴嘧氯草醚的保留情况，结果表明，在两种体系下，酸性氧化铝填料对溴嘧氯草醚保留作用弱，药物几乎在上样步骤全部流出。（2）药物在艾杰尔公司和Waters公司的C18固相萃取小柱保留均较好，而且回收率为99%～103%，考虑到艾杰尔公司的C18柱一次性上样体积大于Waters 公司的HLB柱，故在实验中优先采用了艾杰尔的C18固相萃取小柱。

3.3 标准曲线以及基质效应

将2.2节配制的0.0005～0.02 mg/L溴嘧氯草醚系列标准工作溶液按2.5节的仪器条件进样，每个浓度重复进样3次，以浓度峰面积绘制溴嘧氯草醚标准曲线，其回归方程为 y=5219034.5741x-689.6385（R2=0.9999）。

配制0.0025 mg/L 溴嘧氯草醚溶剂标样，同时称取空白土壤、沉积物和水样，按照前处理步骤提取净化，并对空白样品进样分析，确定其不含痕量该类药物后再用空白样品液配制同溶剂标样浓度的基质标样，用基质标样的峰面积除以溶剂标样的峰面积得到的比值r评价基质效应，同时也考察了基质标样稀释10倍后的消除基质效应的效果。由图3可见，

不同环境样品基质对溴嘧氯草醚的仪器响应影响有差异：（1）土壤B、土壤C、水基质对溴嘧氯草醚均有基质增强效应，其中，土壤C基质对基质增强效应最明显，r=1.761； （2）沉积物基质对溴嘧氯草醚有基质抑制作用，r=0.880。（3）土壤A对溴嘧氯草醚的基质效应不明显，r=0.982。有明显基质抑制和基质增强效应的基质标样稀释10倍后，基质效应基本可以消除。

3.4 方法的检出限、准确度和精确度

根据空白样品的3倍信噪比确定方法的检出限，10倍信噪比确定方法的定量限，溴嘧氯草醚的检出限为0.055 μg/kg或μg/L； 定量限为0.2 μg/kg或μg/L。

在空白土壤、沉积物和水样中进行了0.005、0.05和2.0 mg/kg添加回收实验，每档浓度重复5次，按前处理方法提取、净化。结果见表2， 土壤中溴嘧氯草醚的平均回收率为89%～106%，相对标准偏差（RSD）为3.0%～8.0%； 沉积物溴嘧氯草醚的平均回收率为93%～102%，RSD为2.8%～4.9%； 水中溴嘧氯草醚的平均回收率为87%～99%， RSD为3.1%～6.7%，详见表2。 本方法满足土壤、沉积物和水样中溴嘧氯草醚残留分析要求，为环境中该类药物检测提供了参考方法。土壤、沉积物和水样的添加回收谱图见图4（A～K）。

3.5 溴嘧氯草醚土壤降解特性研究

考察了溴嘧氯草醚在3种不同类型的土壤中的降解特性，样品测定色谱图见图4（L～N）， 实验结果和降解曲线见图5。溴嘧氯草醚在土壤A中降解最快，好氧和厌氧半衰期分别为1.72和2.93 d； 溴嘧氯草醚在土壤B中好氧和厌氧半衰期分别为18.1 和24.2 d； 溴嘧氯草醚在土壤C中好氧和厌氧半衰期分别为28.2 和31.4 d。溴嘧氯草醚在3种土壤样品中降解速度快慢依次为：土壤A>土壤B>土壤C，而且溴嘧氯草醚在土壤A降解速度远快于土壤B和土壤C。这可能与土壤的pH值、阳离子交换量和土壤质地有关，土壤酸性越强、阳离子交换量越大，溴嘧氯草醚降解越快。在3种土壤中，同种土壤比较，好氧条件下的降解速度快于厌氧条件下的降解速度， 这可能是因为在好氧条件下更能促进好氧微生物生长，与厌氧微生物相比，好氧微生物更能促进溴嘧氯草醚的降解。

4 结 论

本研究建立了环境样品中溴嘧氯草醚的检测方法，研究了溴嘧氯草醚在3不同性质土壤的降解特性，并采用建立的检测方法检测了土壤降解样品，结果表明， 本方法实用、准确， 溴嘧氯草醚在同一种土壤中的降解速率，好氧条件的降解速度快于厌氧条件， 溴嘧氯草醚在不同性质土壤中降解速率差异较大，其降解的快慢可能与土壤的pH值、阳离子交换量和土壤质地有关。endprint