三七总皂苷对线粒体调控作用的研究进展

杨子平+包怡敏

[摘要]线粒体是细胞关键的能量来源，在能量合成与释放、细胞功能维持方面具有重要作用。三七总皂苷作为中药三七中最重要的活性成分，具有抗血栓形成、扩血管、降血压、抗炎、抗氧化等作用。国内外研究表明，三七总皂苷参与调节线粒体能量代谢、氧化应激、生物合成、凋亡与自噬及膜通道状态等，故线粒体是三七总皂苷生物活性的重要靶点。该文就三七总皂苷对线粒体的调控作用做一综述。

[关键词] 三七总皂苷； 线粒体； 能量代谢； 氧化应激； 线粒体ATP敏感性钾通道； 线粒体自噬； 线粒体膜通透性转换孔

[Abstract] Mitochondria is the key energy source of cells and plays an important role in energy synthesis and release， and maintenance of cellular functions. As the most important active ingredients in Chinese medicine pseudo-ginseng， Panax notoginseng saponins（PNS） have pharmacological effects on protecting against thrombosis， dilating blood vessels， lowering the blood pressure， anti-inflammation， and antioxidant， etc. Domestic and foreign studies have shown that PNS participates in regulating mitochondrial energy metabolism， oxidative stress， biosynthesis， apoptosis， mitophagy and the status of membrane channels. Therefore， the mitochondria is one of the important targets of PNS. In this paper， the regulation effects of P. notoginseng saponins on mitochondria were reviewed.

[Key words] Panax notoginseng saponins； mitochondria； energy metabolism； oxidative stress； mitochondrial ATP-sensitive K⁺ channels； mitophagy； mitochondrial membrane permeability transition pore

线粒体是细胞中重要的细胞器，是真核生物细胞进行氧化磷酸化生成能量的场所，对线粒体内Ca²⁺浓度和pH的维持、介导细胞信号传导、细胞对环境变化的应激反应等也起着非常重要的作用。然而，在衰老、毒性分子等因素的刺激下，线粒体中能量代谢方式发生改变，同时活性氧（reactive oxygen species，ROS）在线粒体内不断积累，当其累积量超过线粒体的承受限度时，便会引发线粒体内多种病理效应：如ROS诱导的ROS进一步释放，线粒体膜上相关通道如线粒体膜通透性转换孔（mitochondrial membrane permeability transition pore，MPTP）与线粒体膜上ATP-敏感性钾通（mitochondrial ATP-sensitive K⁺ channels，mitoKATP）开放，进而导致线粒体自噬与线粒体途径诱导的凋亡。

三七即五加科植物Panax notoginseng（Burk）F. H Chen的干燥根及根莖，有散瘀止血、消肿定痛的功效。而三七总皂苷（P. notoginseng saponins，PNS）一直被认为是决定三七药效最重要的活性成分^[1-2]，其中主要含有人参二醇型皂苷Rb₁、人参三醇型皂苷Rg₁等皂苷单体及生物碱等成分。近年来，国内外一系列研究表明PNS具有扩张血管、降低心肌耗氧量、抑制血小板凝集、延长凝血时间、清除自由基、抗炎、抗氧化等药理作用。然而迄今为止，有关PNS的研究大部分停留在器官组织或者细胞层面，深入到细胞器如线粒体层面的研究较少，故本研究就PNS对线粒体的作用进行综述，以期为临床应用提供理论依据与治疗靶点。

1 PNS参与线粒体能量代谢的调节

线粒体是细胞内氧化磷酸化和形成ATP的主要场所，细胞生命活动所需能量有95%来自线粒体，故其又被称为细胞的“动力工厂”。线粒体能量代谢方式主要有氧化呼吸链和三羧酸循环（TCA）2种，因此线粒体能量代谢的调节主要通过调节不同能量代谢途径上关键酶的活性来实现^[3]。

TCA关键酶主要包括柠檬酸合酶（CS）和细胞色素C氧化酶（COX）。CS广泛分布在原核生物和真核生物中，控制三羧酸循环的入口，可催化乙酰辅酶A与草酰乙酸缩合生成柠檬酸^[4]。COX是呼吸链中的电子传递和线粒体氧化磷酸化中关键酶的最终复合物，在能量产生中也起重要作用。这2种是限速酶并且是线粒体能量代谢中的关键酶，它们的活性可以反映线粒体能量代谢功能。研究表明，CS和COX的活性降低可诱导氧化应激，进而产生过量的ROS，引起线粒体能量代谢异常与细胞损伤^[5]。另有实验证明，在以半乳糖胺和脂多糖诱导的急性肝衰模型的肝细胞凋亡期间，CS和COX的活性增强，说明这些酶通过增强自身活性促进线粒体能量代谢以满足肝细胞凋亡所需能量，从而参与急性肝衰的启动和发展^[6]。

除以上2种参与TCA的调节酶以外，还有多种酶通过参与线粒体氧化磷酸化对线粒体能量代谢进行调控，如乳酸脱氢酶（LDH）、琥珀酸脱氢酶（SDH）、ATP酶与ATP合酶等。LDH参与糖酵解和能量代谢，其变化直接影响机体的能量代谢^[7]；SDH作为线粒体标记酶反映柠檬酸循环的状态，其活性可反映线粒体数量和有氧氧化水平，间接反映组织氧供应情况^[8-9]。此外，ATP酶与ATP合酶也是重要的能量代谢酶。ATP合酶在线粒体呼吸链中可催化ADP和Pi生成ATP，故其也能直接反映线粒体的能量代谢情况。ATP酶在催化能量转换、物质转运和信息传递等过程也发挥重要作用。当机体处于缺氧、疾病等病理状态时，线粒体能量代谢受到抑制，ATP 酶活性也相应地明显降低。

PNS可通过调节相关酶的活性影响线粒体能量代谢过程。实验证明，PNS可以有效提高肾缺血再灌注后肾细胞线粒体中COX，SDH活性，减少线粒体能量合成功能的损伤^[10]。赵静宇等人的实验结果显示，在线粒体受损时，PNS能有效抑制LDH漏出，维护线粒体正常能量合成与释放，抑制细胞活力下降^[11-12]。就单体而言，PNS中的单体成分Rg₁可明显提高出血性休克

5 h大鼠肠上皮细胞线粒体COX活性，改善能量代谢异常，减少细胞损伤^[13]。此外，另外一种单体Rb₁可显著提高慢性阻塞性肺疾病大鼠肺组织线粒体中呼吸链复合体Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ及ATP合酶活性，增强线粒体中的能量合成与释放，有利于线粒体结构与功能的恢复^[14]。陈社带等的实验表明，在缺血条件下，PNS可明显提高ATP酶活性，促进线粒体能量转换与生成，减少因缺血引发的线粒体功能紊乱以及心肌细胞损伤^[15]。

2 PNS参与氧化应激相关的线粒体机制调节

线粒体参与的氧化反应是维持生命所必需的过程，但氧化反应亢进就形成了氧化应激（oxidative stress，OS）。正常生理情况下，ROS 在体内不断生成，又在强大的自由基清除系统（如SOD，GSH-Px，CAT，NADP /NADPH，GSH等）作用下不断被清除，保持着动态平衡。如果这一平衡遭到破坏，ROS大量聚集，线粒体的功能结构域暴露于高浓度的ROS下，便可诱发OS。轻度OS往往具有促进细胞存活、增殖、分化等保护作用，重度OS则造成增殖阻滞、衰老、凋亡和坏死等损伤性变化，同时参与触发MPTP开放、线粒体途径凋亡和线粒体自噬等线粒体病理生理机制。PNS可通过调节线粒体内ROS水平影响OS，进而调控与氧化应激相关的线粒体机制。

2.1 PNS对活性氧的调控作用 活性氧类是氧化系统产生的含有活性氧功能基团的化合物，包括含氧自由基、氧的非自由基衍生物、氢过氧化物等。线粒体是氧化应激诱导的ROS的主要来源^[16]，活性氧类本身又可诱导线粒体产生更多的活性氧类，这一现象称为活性氧诱导的活性氧释放^[17]。低浓度的ROS对线粒体功能具有保护作用，而高浓度ROS对线粒体则是有害的。在ROS大量聚集的情况下，线粒体氧化损伤进一步加重，能量代谢受阻（呼吸酶活性与呼吸链的电子传递受到抑制）、氧化酶与抗氧化酶活性改变、线粒体膜电位去极化、MPTP不可逆性开放、线粒体膜通透性增加、Ca²⁺代谢紊乱等，最终导致线粒体形态破坏与功能丧失。

PNS对线粒体ROS的调控作用体现在两方面，一是直接抑制ROS的生成与累积；二是通过氧化酶和抗氧化酶对ROS进行间接调控。赵静宇等的研究显示，在氧化应激中，PNS可减少ROS和氧化产物丙二醛（MDA）的产生，增加超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活力，稳定线粒体膜电位，减少线粒体氧化损伤^[11-12]。另有实验表明，在高脂诱导的脂肪肝大鼠模型氧化應激中，经PNS治疗后，线粒体中羟自由基，MDA浓度降低，而总超氧化物歧化酶（T-SOD）及血清总抗氧化能力（T-AOC）的活性恢复^[18]。此外亦有研究发现，PNS在氧化损伤所致的PC12细胞中能有效减少损伤后ROS的生成和线粒体膜电位的去极化^[19]。因此，PNS在氧化应激中可以通过抑制ROS在线粒体中的生成及堆积维持或恢复线粒体内环境的稳态，减轻线粒体氧化损伤。

2.2 PNS 对线粒体膜通透性转换孔的调节 线粒体膜通透性转换孔是一种高电导性巨型通道，由线粒体外膜的电压依赖性阴离子通道（VDAC）、内膜上的腺苷酸转运蛋白（ANT）和基质中的亲环蛋白D（CyP-D）组成。MPTP在生理条件下主要处于关闭状态，仅对一些选择性的代谢底物和离子有通透性；在应激状况下，ROS和Ca²⁺超载等诱发MPTP开放，相对分子质量小于1.5 kDa的物质可以通过，引起线粒体基质蛋白的渗透压升高，导致基质水肿、线粒体外膜损伤、细胞色素C（CytC）与凋亡诱导因子（AIF）释放以及线粒体膜电位去极化，诱导线粒体凋亡。同时，MPTP在ROS诱导的ROS释放中也发挥着重要作用：过多的ROS诱发MPTP开放，导致CytC及吡啶核苷酸丢失而抑制呼吸链，进而促进ROS的产生，加重组织损伤^[20]。

实验表明，PNS中单体Rg₁能增强线粒体抗氧化能力，抑制应激条件下MPTP的开放，进而减少因凋亡因子如环加氧酶-2、前胱天蛋白酶-9（pro-caspase-9）、前胱天蛋白酶-12（pro-caspase-12）和胱天蛋白酶-3（caspase-3）的释放与表达引起的线粒体破坏，对因MPTP开放引起的行为损伤起到神经保护作用^[21]。由此推测，PNS作为多种皂苷单体的复合物，亦能通过抑制MPTP的开放，减少凋亡因子的释放，维持线粒体膜电位的稳定，降低线粒体在应激状态下的结构与功能受损。

2.3 PNS对线粒体途径凋亡的调控作用 线粒体凋亡通路是指细胞受到凋亡刺激后线粒体膜通透性发生改变，引起膜间隙内促凋亡分子的释放，致使细胞发生凋亡。线粒体途径作为细胞凋亡的主开关，在细胞凋亡中起决定性作用。线粒体内含有大量可引起细胞损伤的物质^[22-23]，包括CytC，Bcl-2基因家族，caspase家族，肿瘤坏死因子等。在氧化应激状态下，线粒体内ROS不断生成并累积，诱导MPTP通道开放，引发线粒体膜电位的去极化。线粒体膜电位的去极化仅发生于经线粒体诱导的凋亡途径中^[24-25]，实验证实，线粒体在死亡信号的诱导下，线粒体膜通透转换孔开放，线粒体膜电位去极化，是细胞凋亡的早期特征^[26]。MPTP开放导致线粒体膜电位去极化，促使众多凋亡因子释放，最终引起线粒体途径诱导的细胞凋亡。

一系列实验证明，PNS可通过介入凋亡因子的释放对线粒体途径引起的细胞凋亡起到调控作用。在顺铂诱导的大鼠肾细胞损伤模型中，PNS能通过减少线粒体中Bax和caspase-9的表达、上调Bcl-2的表达来抑制线粒体途径凋亡，从而对顺铂诱导的肾毒性起到细胞保护作用^[27]。Meng等的实验显示，在大脑缺血再灌注损伤的体内和体外模型中，PNS单体Rg₁可通过抑制线粒体膜的潜在破坏、caspase-3的激活和DNA破碎来抑制凋亡，明显改善神经学结果并减少脑梗死面积^[28]。另一种PNS单体Rb₁经实验证明在H₂O₂诱导的心肌细胞中一定程度上降低H₂O₂引起的细胞损伤，稳定细胞线粒体的结构和功能，抑制H₂O₂诱导的心肌细胞凋亡^[29]。而另一实验结果却显示，在H₂O₂诱导基底动脉平滑肌细胞（BASMCs）的氧化应激模型中，人参皂苷Rd可增加CytC的释放以及caspase-9/caspase-3的激活，降低线粒体膜电位的稳定性和Bcl-2/Bax的比例，增强H₂O₂诱导的细胞死亡和凋亡，从而抑制细胞增殖，抗动脉重构^[30]。此外，在人淋巴细胞瘤JK细胞模型中，人参皂苷Rg₆可以导致线粒体功能障碍以及Bax表达增加，Bcl-2表达减少，从而抑制人体淋巴细胞瘤的增殖并诱发它的凋亡^[31]。以上实验中Rg₁，Rb₁，Rd，Rg₆均为从PNS中分离出的单体，在作用于线粒体途径的凋亡时，Rd和Rg₆表现出促进作用，而PNS的作用与Rg₁，Rb₁一致，表現出抑制作用。对于以上实验结果，作者对此作出2种推测：第一，这可能与PNS中各单体成分含量有关。Rg₁和Rb₁是PNS的主要成分，因此PNS的药理作用很大程度上受这2种单体影响而表现出抑制凋亡作用。其他单体如Rd，Rg₆等单独使用时，它们对线粒体途径凋亡的作用可能与PNS或者其他单体存在差异，但是当它们存在于PNS中作为整体作用于线粒体时，由于占比太小，因此对线粒体途径凋亡的促进作用被完全掩盖或抵消，PNS并不会表现出这部分单体的功效。第二，这也可能是由于PNS作用于不同模型可产生不同效应，抑制凋亡可发挥细胞保护作用，而促凋亡则有利于清除受损细胞、抑制细胞增殖。所以，虽然PNS的不同单体成分在线粒体途径凋亡方面表现出不同的实验结果，它在抑制线粒体途径凋亡方面的作用仍然客观存在，机制研究有待进一步深入。

2.4 PNS对线粒体自噬的调控作用 线粒体自噬是指细胞通过自噬的机制选择性地清除线粒体的过程。通过该途径，细胞可降解并清除受损或功能障碍的线粒体，以维持细胞内线粒体质量和数量的平衡，从而维持细胞稳态。适度的线粒体自噬可快速选择性地清除受损线粒体，以免其产生的大量ROS损伤其他线粒体的蛋白质和DNA，从而对线粒体和细胞起到保护作用。然而，过度的线粒体自噬会导致细胞内线粒体的清除过度，导致线粒体数目不足以及功能的破坏。

目前研究认为，PNS主要通过缺氧诱导因子1（HIF-1）/腺病毒E1B相互作用蛋白3（BNIP3）这一通路对线粒体自噬发挥调控作用。实验证明，PNS可显著提高HIF-1α，BNIP3，自噬相关基因Atg5和Beclin-1在大鼠肾组织中的表达以及微管相关蛋白-1轻链LC3II/LC3I的比例，由此证实PNS对顺铂诱导肾毒性的保护作用主要通过HIF-1α/BNIP3途径增强肾组织中的线粒体自噬^[32]。

3 PNS参与线粒体膜上ATP-敏感性钾通道的调节

ATP敏感性钾通道最早由日本学者Noma在豚鼠的心肌细胞上发现。它不同于其他类型的钾通道电生理学特性，是由细胞内ATP调节的一类选择性的非电压依赖性钾离子通道。1991年，Lnoue等在大鼠的肝细胞线粒体内膜上证实了mitoK_ATP的存在^[33]。此通道在正常情况下处于关闭状态，但在组织缺血、缺氧或能量耗竭时被大量激活。MitoK_ATP可以抑制线粒体中活性氧的过度产生^[34]，抑制线粒体膜电位的去极化。此外，mitoK_ATP通道的开放可减弱Ca²⁺负载，既可维持线粒体基质体积，又可防止在再灌注期间MPTP的开放，抑制氧化磷酸化并促进促凋亡蛋白的释放^[35]。

PNS在氧化应激条件下可通过促进mitoK_ATP的开放减少线粒体损伤。实验证明，PNS可浓度依赖性改善大鼠心肌缺血/再灌注后心功能的恢复；预先应用非特异性K_ATP阻断剂格列本脲可完全消除PNS对缺血/再灌注心脏的保护作用；而特异性mitoK_ATP阻断剂5-HD能够大部分阻断PNS改善心功能作用，说明PNS主要通过促进mitoK_ATP开放发挥抗再灌注损伤作用^[36]。

4 PNS参与线粒体生物合成的调节

线粒体生物合成是线粒体正常发挥功能与保持结构完整的前提，这一过程受多种因素影响，如线粒体转录因子A（mitochondrial transcription factor A，TFAM，也称为mTFA）、过氧化物酶体增生物激活受体（peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR）、辅助活化因子1α（PGC-1α）以及核呼吸因子-1（nuclear respiratory factor-1，NRF-1）等。TFAM是线粒体的一个DNA结合蛋白，在mtDNA的转录、复制和维护上处于中心地位。TFAM通过结合在mtDNA 轻链和重链启动子的上游来促进mtDNA的转录^[37]。线粒体启动子的起始由TFAM的量调节，所以TFAM可影响基因的表达和mtDNA的转录起始；PGC-1α是线粒体生成的关键调控因子^[38]，可增强核受体及相关转录蛋白的转录活性，刺激线粒体合成和呼吸的发生^[39]；NRF-1作用于线粒体血红素合成，是相关基因和线粒体蛋白转运基因，对于核基因和线粒体基因的表达具有辅助调控作用，是线粒体生物合成中最主要的合成因子，它在线粒体内引起线粒体DNA的双向转录。此外，研究已经证明PGC-1α与NRF1相互作用，在线粒体生物合成过程中起到关键调节因子的作用^[40]。NRF1激活基因转录来参与线粒体骨架合成，PGC-1α负责调节线粒体生物合成的基因网路。PNS可通过这3种因子参与对线粒体合成的调控作用。研究表明，PNS在葡萄糖/葡萄糖氧化酶（G/GO）诱导的H9c2细胞中进行预处理后能够明显升高心肌细胞PGC-lα，NRFI，TFAM和COXI基因的mRNA水平，促进线粒体合成，抑制应激状态下线粒体的破坏以及功能紊乱^[41]。然而，对PNS在线粒体生物合成方面作用的实验研究较少，此机制是否普遍适用仍有待探究。

5 结语与展望

综上所述，PNS可通过多种途径对线粒体功能进行调控：通过相关代谢酶介导促进线粒体内能量的转换与生成；在应激状况下抑制ROS在线粒体内的产生与积累，增强抗氧化酶活性，抑制氧化酶活性，维持线粒体膜电位稳定以及促进mitoK_ATP开放，抑制MPTP的不可逆开放，保護线粒体内环境；还可调控线粒体自噬，双向调节线粒体途径的细胞凋亡；此外，PNS通过相关因子在线粒体上的表达调节线粒体的生物合成。由于线粒体在细胞中的重要地位，PNS以线粒体作为靶点，可以为临床应用提供新的思路与方向。然而，关于PNS对线粒体的作用与机制研究的实验报道仍较少，新的角度和观点仍待进一步的发现与探索。

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[责任编辑 曹阳阳]