勐库大叶种茶树多酚氧化酶粗酶的酶学性质

伍梦瑶，黄莹捷，姚燕妮，黄友谊

勐库大叶种茶树多酚氧化酶粗酶的酶学性质

伍梦瑶，黄莹捷，姚燕妮，黄友谊*1

（园艺植物生物学教育部重点实验室/华中农业大学园艺林学学院茶学系，武汉430000）

以云南大叶种代表性品种勐库大叶种茶树鲜叶为原料，对以硫酸铵沉淀制备的多酚氧化酶（polyphenol oxidase,PPO）粗酶进行部分酶学性质研究。结果表明，勐库大叶种PPO最适反应pH为4.4，最适反应温度为37℃，对焦性没食子酸、邻苯二酚有催化活性，而对间苯二酚、对苯二酚基本无催化活性。以焦性没食子酸、邻苯二酚为底物时，勐库大叶种PPO的米氏常数（Km）分别为4.2 mmol/L和36.5 mmol/L，最大单位酶活力（Vmax）值分别为2 000 U/mL和5 000 U/mL，且对焦性没食子酸的催化效果优于邻苯二酚。抑制剂乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）、亚硫酸钠、抗坏血酸和L-半胱氨酸对勐库大叶种PPO的抑制效果均随抑制剂浓度的增大而增强，其中亚硫酸钠的抑制作用最强。在终浓度为0～10.00 mmol/L范围内，除Na+对勐库大叶种PPO活性有一定的抑制作用外，K+、Cu2+和Mg2+对勐库大叶种PPO活性均有不同程度的促进作用。不同来源的茶树PPO酶学性质有着明显的区别，可能与品种适制性有直接的联系。

勐库大叶种茶树；多酚氧化酶粗酶；酶学性质

多酚氧化酶（polyphenol oxidase,PPO,EC 1.10.3.1）是一种Cu2+辅基结合酶[1]，在自然界中通常是以无活性的前体形式定位于质体内囊体中，由核基因编码且由多个核基因控制，其数量、类型在不同物种和品种间均存在差异[2-3]。PPO在茶树生长发育[4-5]和茶叶加工过程[6]中均起着重要作用，是形成发酵茶色泽与香气的关键，其催化产物对茶叶香气[7]、滋味[8-9]有直接影响，催化形成的茶黄素总含量与红茶整体品质及估值呈极显著正相关[10]。

为探究茶树PPO的性质，提升茶叶品质，茶树PPO的分离纯化与性质分析一直以来都受到国内外的关注。研究发现，不同茶树品种的分离纯化方法、最适条件及性质均存在差异，这能在一定程度上解释不同品种茶树的适制性差异。这方面的研究现已涉及福鼎大白、福云6号、乌牛早等诸多茶树品种[11-13]，但对遗传信息较原始[14]、适制红茶的云南大叶种PPO的研究尚未见报道。本试验选用云南大叶种代表性品种——勐库大叶种茶树鲜叶为原料，经硫酸铵沉淀获得PPO粗酶，对其酶学性质进行研究，为调节PPO活性和阐明云南大叶种茶树的红茶适制性提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

勐库大叶种茶树（Camellia sinensis var.assamica cv.Mengku）鲜叶于2016年春季采摘自华中农业大学茶学教学实习基地，采摘规格为一芽二叶。磷酸氢二钠、聚乙烯吡咯烷酮、硫酸铵、脯氨酸、尿素、邻苯二酚、对苯二酚、间苯二酚、焦性没食子酸、亚硫酸钠、抗坏血酸、L-半胱氨酸等均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 勐库大叶种PPO的制备

取茶树鲜叶20 g，加入3 g聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和适量海砂，用60 mL柠檬酸-磷酸盐缓冲液（0.1 mol/L，pH 7.2）冰浴研磨均匀后，于4℃冰箱静置浸提12 h。浸提液于4℃、9 000 r/min离心40 min后，取上清液，得PPO粗酶液Ⅰ（简称为PPO粗酶Ⅰ）。PPO粗酶液Ⅰ用终质量分数为30%的硫酸铵饱和沉淀3 h后，于4℃、9 000 r/min离心30 min，取上清液；上清液再用终质量分数为80%的硫酸铵饱和沉淀6 h，然后于4℃、9 000 r/min离心30 min，弃上清液，得沉淀；沉淀用0.02 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.2）溶解后，于4℃、3 500 r/min离心至洗脱液呈淡黄色，上清液经脱盐浓缩后，得到勐库大叶种PPO粗酶液Ⅱ（简称为PPO粗酶），为本文研究对象。

1.3 PPO酶活性与蛋白质含量测定

1.3.1 PPO活性测定方法

取10 μL酶液于酶标板中，加入50 μL柠檬酸-磷酸盐缓冲液（0.1 mol/L，pH 5.6）和75 μL酶反应混合液[m（0.1 mol/L柠檬酸-磷酸盐缓冲液）∶m（0.1%脯氨酸）∶m（1%邻苯二酚）＝10∶2∶3，现配现用]，置于37℃恒温水浴锅中反应30 min后，立即加入50 μL 6 mol/L尿素终止反应，置于酶标仪中于410 nm下测定吸光度值。对照组中加入煮沸10 min的酶液代替。在本试验条件下，将反应液的吸光度值每分钟增加0.001定义为1个酶活力单位，U。

1.3.2 PPO蛋白浓度测定方法

依照BRADFORD法[15]，使用蛋白定量试剂盒（上海碧云天生物试剂有限公司）进行蛋白含量测定。取10 μL酶液于酶标板中，依次加入10 μL磷酸盐缓冲液（0.05 mol/L，pH 7.2）、200 μL G250染色液（0.01%），室温反应10 min，置于酶标仪中于595 nm下测定吸光度值。以牛血清蛋白（BSA）为标样制作蛋白标准曲线，吸光度值与蛋白质浓度成正比。

1.4 不同反应条件对PPO活性影响试验

1.4.1 不同pH值对PPO活性影响试验

依照1.3.1节的方法测定PPO酶活性，其中酶反应缓冲液分别选用pH值为4.0、4.4、4.8、5.2、5.6、6.0、6.4、6.8、7.2、7.6、8.0的0.1 mol/L柠檬酸-磷酸盐缓冲液。将测得的最大单位酶活力值记为100%，计算其他反应pH下的PPO相对酶活力。

1.4.2 不同反应温度对PPO活性影响试验

依照1.3.1节的方法测定PPO酶活性，其中反应温度分别设置为20、25、30、35、37、40、45、50、55、60℃。将测得的最大单位酶活力值记为100%，计算其他反应温度下的PPO相对酶活力。

1.4.3 不同底物对PPO活性影响试验

依照1.3.1节的方法测定PPO酶活性，其中底物分别为邻苯二酚、对苯二酚、间苯二酚和焦性没食子酸溶液，各底物浓度设置为4、12、16、20、24、30 mmol/L。

1.4.4 PPO动力学常数测定

依照1.3.1节的方法测定PPO酶活性，其中反应底物分别选用反应体系中终浓度分别为4、12、16、20、24、30 mmol/L的邻苯二酚、焦性没食子酸溶液。作反应底物浓度与单位酶活力的双倒数图，根据斜率公式计算米氏常数（Km）和最大单位酶活力（Vmax）值。

1.4.5 抑制剂对PPO活性影响试验

依照1.3.1节的方法测定PPO活性，其中缓冲液分别选用含有乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）、亚硫酸钠、抗坏血酸（Vc）、L-半胱氨酸、柠檬酸（各抑制剂在缓冲液中的终浓度分别设置为0、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 mmol/L）的0.1 mol/L柠檬酸-磷酸盐缓冲液（pH 5.6）。以未加抑制剂条件下的酶样品单位酶活力值记为100%，计算添加不同浓度抑制剂的PPO相对酶活力。

1.4.6 金属离子对PPO活性影响试验

依照1.3.1节的方法测定PPO酶活性，其中缓冲液分别选用含有Na+、K+、Cu2+、Mg2+（各金属离子在缓冲液中的终浓度分别设置为 0、0.05、0.10、0.50、1.00、5.00、10.00 mmol/L）的0.1 mol/L柠檬酸-磷酸盐缓冲液（pH 5.6）。以未加金属离子条件下的酶样品单位酶活力值记为100%，计算添加不同浓度金属离子的PPO相对酶活力。

1.5 数据分析

所有数据均是3次重复试验的平均值，误差线表示3次重复试验的标准偏差。使用SPSS 18.0对试验数据进行方差分析和显著性检验。

2 结果与分析

2.1 勐库大叶种茶树PPO粗酶的制备

经匀浆浸提法提取勐库大叶种茶树PPO后，分别以终质量分数为30%、80%的硫酸铵对其进行沉淀和脱盐浓缩，得到PPO粗酶液Ⅱ（后简称为PPO粗酶）。由表1可看出，经硫酸铵沉淀后，总酶活虽略有降低，但比活力和纯化倍数依次升高。总酶活回收率为70.71%，表明制备获得大部分勐库大叶种PPO。经测定，PPO粗酶的单位酶活为3 493.33 U/mL，比活力为5 744.26 U/mg。

2.2 不同pH值对PPO粗酶活性的影响

在不同pH值的缓冲液中测定勐库大叶种PPO粗酶的活性。结果（图1）显示：当pH为4.4时，PPO酶活性达到最大值；当pH降为4.0时，PPO相对酶活性为90.48%，极显著低于pH 4.4时的活性（p＜0.01）；当pH从4.4逐渐增加到8.0时，PPO酶活性逐渐下降，且相互之间均存在统计学上的极显著差异（p＜0.01）。COGGON等[11]测得美国立顿茶园的茶树鲜叶PPO粗酶最适pH为5.7；赵淑娟等[16]测得槠叶齐茶树PPO粗酶的最适pH为5.6；孙慕芳等[17]测得信阳群体种茶树PPO粗酶的最适pH为5.5。以上的茶树PPO最适pH均大于5.0，而在本试验中，勐库大叶种茶树PPO粗酶的最适pH呈偏酸性（pH 4.4），与这些报道存在明显差异。结合红茶发酵叶pH值逐渐降低的变化趋势[18]，这可能是导致云南大叶种在茶树品种特性、茶类适制性等方面区别于其他茶树品种的内在原因之一。

表1 勐库大叶种茶树PPO纯化结果Table 1 Purification of PPO isolated from Camellia sinensis var.assamica cv.Mengku

图1 勐库大叶种茶树PPO粗酶在不同反应pH值下的相对酶活性Fig.1 Relative enzymatic activity of crude PPO under differentreaction pH values

2.3 反应温度对PPO粗酶活性的影响

在不同反应温度下测定勐库大叶种PPO粗酶的活性，结果见图2。从中可知：在反应温度从20℃增至60℃的过程中，PPO粗酶的相对酶活性整体呈现出先增大后减少的变化趋势，且在37℃时的相对酶活性最高；当反应温度由20℃升至30℃过程中，PPO相对酶活性由51.00%逐渐增至63.47%，相互间差异有统计学意义（p＜0.05）；反应温度从30℃上升到35℃时，PPO相对酶活性由63.47%陡然增至97.70%，相互之间在统计学上有极显著差异（p＜0.01）；在35～40℃之间，PPO相对酶活性保持稳定，且相互间无显著差异（P＞0.05）；当反应温度升高到45℃时，PPO相对酶活性呈现极显著的下降（p＜0.01）；之后随反应温度的上升，PPO相对酶活性均表现为极显著的下降（p＜0.01）；至反应温度为55℃和60℃时，PPO粗酶的相对酶活性分别降至35.97%和16.89%。茶树PPO的最适反应温度随品种与生长条件的不同而各有差异：槠叶齐茶树PPO的最适反应温度为50℃[16]；信阳群体种茶树PPO的最适反应温度为35～40℃[17]；以采自四川同一茶园的名山131、福鼎大白茶、福选9号、乌牛早和平阳特早为酶源制得的PPO最适反应温度均为45℃[19]。由此可见，云南大叶种PPO粗酶最适反应温度与信阳群体种相似，但低于其他很多茶树品种的PPO最适反应温度。

图2 勐库大叶种茶树PPO粗酶在不同反应温度下的相对酶活性Fig.2 Relative enzymatic activity of crude PPO at different reaction temperatures

2.4 不同底物对PPO粗酶活性的影响

选择邻苯二酚、对苯二酚、间苯二酚和焦性没食子酸为反应底物，分别以不同浓度进行酶反应，测得勐库大叶种PPO粗酶的酶活性。结果（图3）表明：以对苯二酚和间苯二酚为底物时，在较高底物浓度（30 mmol/L）条件下PPO粗酶的单位酶活仍旧很低，接近于0；而以邻苯二酚和焦性没食子酸为反应底物时，均能在较低的底物浓度时就显现出较高的单位酶活力，其中当底物浓度为4 mmol/L时，PPO粗酶的单位酶活分别为492.22 U/mL和1 030.00 U/mL。纯化自碧螺春鲜叶原料的PPOⅠ对上述底物均有催化活性，而其PPOⅡ对对苯二酚无催化能力[13]；凤庆PPOⅠ和PPOⅡ对上述底物及没食子酸均表现出催化活性[20]；纯化自土耳其黑海地区茶叶的PPO对邻苯二酚、4-甲基邻苯二酚和焦性没食子酸均有催化活性，而对没食子酸无催化活性[12]；纯化自白毫早[21]、龙井43[22]、福云6号[23]、乌牛早等[19]茶树品种的PPO均能以邻苯二酚为底物进行催化反应。这表明来自不同茶树品种的PPO对底物具有选择性，而这种催化活性差异可能会对各茶树品种的适制性产生影响。

图3 勐库大叶种茶树PPO粗酶在不同底物条件下的相对酶活性Fig.3 Relative enzymatic activity of crude PPO under different substrate conditions

2.5 PPO粗酶动力学常数

依据勐库大叶种PPO对底物的选择性（图3），分别以邻苯二酚、焦性没食子酸为底物，以双倒数作图法测定勐库大叶种PPO粗酶的酶动力学常数（Km）。结果（图4）表明：以邻苯二酚为底物时，Km为36.5 mmol/L，Vmax为5 000 U/mL；以焦性没食子酸为底物时，Km为4.2 mmol/L，Vmax为2 000 U/mL。根据Vmax/Km比值，勐库大叶种PPO粗酶对焦性没食子酸的Vmax/Km大于邻苯二酚，表明其对底物焦性没食子酸具有更好的催化效果。以邻苯二酚为底物时，信阳群体种PPO酶的Km为140.6 mmol/L[17]，凤庆PPOⅠ和Ⅱ的Km分别为4.424和3.457 mmol/L，Vmax（单位时间内在460 nm波长处的吸光度值）分别为0.146和0.305[20]，而龙井43号 PPOⅡ的Km和Vmax（单位时间内在460 nm波长处的吸光度值）分别为13.05 mmol/L和0.019[24]，龙井43号 PPOⅠ和Ⅲ的Km分别为91.34和51.65 mmol/L[22]；以焦性没食子酸为底物时，凤庆PPOⅡ的Km为3.455 mmol/L，Vmax（单位时间内在460 nm波长处的吸光度值）为0.291[20]。这说明同一种PPO对不同底物的亲和力不同，PPO与某一底物间的亲和力与酶源及同工酶构成有关。

图4 勐库大叶种茶树PPO粗酶催化不同底物的双倒数关系图Fig.4 Double reciprocal plots of crude PPO using catechol and pyrogallic acid as substrate

2.6 不同抑制剂对PPO粗酶活性的影响

在0～1.00 mmol/L浓度范围内，不同抑制剂对勐库大叶种PPO粗酶活性的影响如图5所示。从中可知：在0～1.00 mmol/L浓度范围内，尽管柠檬酸浓度的增加使PPO活性略微增加，但其影响未达统计学上的显著水平（P＞0.05）。随着EDTA-2Na浓度的增加，PPO相对酶活性呈显著下降的趋势（p＜0.05），但当浓度高达1.00 mmol/L时，相对酶活性依然维持在96.36%（抑制率仅为3.64%）。PPO相对酶活性随着亚硫酸钠、抗坏血酸、L-半胱氨酸浓度的增加，均呈现出显著下降的趋势（p＜0.05），其中：当亚硫酸钠浓度增加到0.50 mmol/L时，已测不出PPO相对酶活性；当抗坏血酸浓度为0.50 mmol/L时，PPO相对酶活性仅剩27.22%，当浓度为1.00 mmol/L时则仅剩1.66%；当L-半胱氨酸浓度为0.20 mmol/L时，PPO相对酶活性仅剩39.47%，而当浓度为0.50 mmol/L时仅剩12.87%。由此可见，亚硫酸钠和L-半胱氨酸对勐库大叶种PPO酶活性抑制最强，其次为抗坏血酸，而EDTA-2Na和柠檬酸在本试验条件下对PPO酶活性的影响相对较小。

赵淑娟等[16]研究发现，当抗坏血酸、亚硫酸钠和L-半胱氨酸的添加量分别达到0.2、0.3、0.4 mmol/L时，均可完全抑制槠叶齐茶树PPO的活性；虞昕磊[20]在研究不同抑制剂对凤庆茶树PPO同工酶活性的影响时发现，抗坏血酸的抑制效果强于亚硫酸钠；陈昌辉等[19]研究发现，添加相同浓度的抗坏血酸、EDTA和NaCl均能抑制名山131、福鼎大白茶等5种茶树PPO的活性，且抗坏血酸的抑制效果最佳；许雷[22]研究发现，当抗坏血酸和L-半胱氨酸的添加量为0.1 mmol/L时可完全抑制龙井43号PPOⅠ的活性，而当亚硫酸钠的添加量为0.2 mmol/L时才能达到相同的抑制效果。上述研究结果与本试验得到的结果存在一定差异，说明抑制剂对不同PPO酶活性的抑制效果存在差异。这可能是由于不同来源的PPO及不同PPO同工酶的蛋白质结构不同，使得各抑制剂的作用效果存在差异。

图5 不同抑制剂对勐库大叶种茶树PPO粗酶活性的影响Fig.5 Effects of different concentrations of inhibitors on the activities of crude PPO

2.7 金属离子对PPO粗酶活性的影响

在不同金属离子浓度下，勐库大叶种PPO粗酶活性的变化情况如图6所示。从中可知：随Na+浓度的增加，PPO酶活显著下降（p＜0.05），但当Na+浓度高达10.00 mmol/L时，PPO相对酶活性依然有78.68%。随K+、Mg2+浓度的增加，PPO酶活均呈现出整体增加的趋势，且不同Mg2+浓度间的PPO活性在统计学上无显著差异（P＞0.05），但不同K+浓度间的PPO活性大多具有显著差异（p＜0.05）。当Cu2+浓度在0～1.00 mmol/L之间时对PPO酶活性无显著影响，但达到5.00 mmol/L和10.00 mmol/L时，PPO酶活性极显著地增加了142.19%和172.85%（p＜0.01）。以往的研究显示：在0.1～10.0 mmol/L浓度范围内，Na+、K+均能对碧螺春PPOⅠ、PPOⅡ产生不同程度的抑制作用，Cu2+能抑制碧螺春PPOⅠ的活性，但对碧螺春PPOⅡ活性有促进作用，Mg2+也对碧螺春PPOⅡ活性有促进作用[13]；在0.1～1.5 mmol/L浓度范围内，Na+能显著抑制茄子的PPO活力，而2.0～4.0 mmol/L的Cu2+则对茄子PPO活性有促进作用，0.5～4.0 mmol/L的Mg2+使茄子PPO活性有所增加，但各数值间无显著差异[25]；在0～3.0×10－4mmol/L浓度范围内，添加Cu2+对凤庆PPOⅠ、PPOⅡ活力的影响呈钟形变化，其酶活性分别在Cu2+浓度为1.0×10－4、0.5×10－4mmol/L时达到最高[20]。这说明部分金属离子可对PPO酶活性产生促进或抑制作用，其中Na+、K+和Mg2+对PPO酶活性的影响规律在不同品种间表现出较高的一致性，但其影响程度随PPO来源及PPO同工酶的不同而有所差异。

图6 不同金属离子对勐库大叶种茶树PPO粗酶活性的影响Fig.6 Effects of different concentrations of metal ions on the activities of crude PPO

3 讨论

3.1 PPO的最适反应pH

本试验发现勐库大叶种PPO粗酶的最适反应pH为4.4，酶活力在酸性条件下整体上较碱性条件下高。通过对比前人的研究可以发现，不同品种间茶树PPO的最适pH存在差异[11,16-17]，这很可能是产生不同品种适制性的原因。在红茶渥红发酵过程中，发酵叶的pH值整体呈现降低的趋势[18]，本研究勐库种茶树PPO的最适pH偏酸性意味着其更易适应红茶发酵过程中pH降低的变化，从而在发酵过程中易保持较高的酶活性，促进渥红发酵，因此勐库种茶树更适制红茶。徐斌[26]的研究表明，偏酸性条件更利于与红茶品质相关的茶黄素的形成，且茶黄素在酸性条件下更稳定。勐库大叶种茶树适制红茶可能与其PPO的最适pH偏酸性有关。我们已有的研究结果表明，勐库大叶种茶树PPO在偏酸性下更有利于催化合成酯型茶黄素[27]，这也可能是云南大叶种适制红茶的根本原因。适制绿茶的品种如龙井 43 号[24]、碧螺春[13]、乌牛早[19]的最适 pH 分别为6.0、6.5和8.6，明显高于勐库大叶种茶树PPO的最适pH，这也较好地支持了这一推断。在茶树PPO粗酶中存在多条PPO同工酶，其最适pH会受到同工酶的数量、比例及性质的影响。本课题组以往的研究[28]发现，龙井43号的PPO粗酶在pH 5.2和8.0下有2个酶活力峰值，但其分离得到的同工酶PPOⅢ-2和PPOⅤ-3的最适pH均为4.4，表明PPO粗酶的最适pH并非其内含同工酶最适pH的简单加成，两者间可能存在更为复杂的联系，有待于深入探讨。

3.2 PPO的最适反应温度

发酵是红茶品质特征成分形成的关键时期，而PPO在这一过程中起了重要作用[29]。发酵温度的变化能对PPO活性进行调控，进而影响红茶品质的形成。本试验测得勐库种茶树PPO粗酶的最适反应温度为37℃，在反应温度为35～45℃时的相对酶活均高于94%，在反应温度为25～30℃时的相对酶活约60%。在传统的红茶生产中发酵时的叶温一般控制在30℃，气温一般为24～25℃[30]，此时勐库种茶树PPO的活性较为适宜，不会因酶活性过高而导致茶黄素含量的降低和茶褐素的大量累积[31]，且与红茶品质呈正相关的茶黄素和茶红素都能够较多地生成与保存[32]。提取自福鼎大白茶、乌牛早等茶树品种的PPO的最适反应温度均高于37℃，在反应温度为25℃时的相对酶活较低[19]，因此，在25℃下发酵可能会因PPO活性过低而影响茶黄素[28]、香气物质等红茶品质成分[32]的形成。这可能是勐库种茶树鲜叶的红茶适制性优于其他品种茶树鲜叶的原因之一。

3.3 PPO的蛋白结构推测

本试验发现亚硫酸钠对勐库大叶种PPO粗酶的抑制作用最强，而大多数研究都显示抗坏血酸对PPO 的抑制效果最佳，优于亚硫酸钠[13，16，20，22，33]。抗坏血酸和亚硫酸钠对PPO的抑制机制不同：前者是抗氧化剂，主要通过降低氧含量来抑制酶促反应，也能将醌还原成酚从而抑制PPO的活力[19]；后者能还原PPO活性中心的Cu2+，使其失活，同时能与邻醌发生不可逆的加成反应[23]，抑制酶活性。基于其抑制机制的差异性，结合本试验结果，我们推测勐库种茶树由于在进化上保留了茶树原始特性[14]，其携带的PPO编码基因可能与其他茶树品种差异较大，具体表现为勐库大叶种PPO蛋白比其他酶源的PPO蛋白存在更多可与亚硫酸钠以共价键结合的必需基团，或其活性中心的Cu2+辅基相对较少，使得亚硫酸钠对其抑制效果更强。而勐库大叶种PPO的蛋白质结构是否与其他品种茶树PPO存在较大差异，以及是否具有一定的规律性等问题，都值得进一步研究。

3.4 Cu2+对PPO活性的影响

PPO的活性中心含有Cu2+，一般认为Cu2+是影响茶树 PPO 活性的重要因素[13，20，22，24]。在本试验中，EDTA-2Na、亚硫酸钠等抑制剂都可有效抑制勐库大叶种PPO粗酶活性，其中EDTA-2Na可通过与PPO的辅基Cu2+螯合来实现对PPO粗酶的抑制[19]，而亚硫酸钠可通过将Cu2+还原为Cu+来抑制PPO粗酶的活性[23]，其抑制机制都涉及与辅基Cu2+的相互作用，表明Cu2+与茶树PPO活性息息相关。张书芹[24]以龙井43号PPO同工酶为研究对象，发现当添加的Cu2+浓度为0.25×10－4mmol/L时PPOⅡ活性最高，之后酶活性随添加的Cu2+浓度的增加而呈波动状态减小；虞昕磊[20]以凤庆PPO同工酶为研究对象，发现PPOⅠ和PPOⅡ分别在Cu2+浓度为0.50×10－4、1.00×10－4mmol/L时的活力最大，之后随浓度的增加同样呈波动状态降低。两者都认为添加Cu2+对PPO活性的影响表现为低浓度促进、高浓度抑制。陈盛虎[28]在探究Cu2+对龙井43号PPO同工酶活性的影响时发现，Cu2+浓度在0.1～10 mmol/L时，酶活力随浓度增加依次增大，当Cu2+浓度超过25 mmol/L后开始出现抑制作用，这与本试验结果基本吻合，但与张书芹[24]和虞昕磊[20]的结果存在差异。由此推测：Cu2+对PPO活性的影响可能是随Cu2+浓度的增大表现出先增后降交替出现的波动式的变化趋势；Cu2+除了与PPO催化活性中心结合外，还可能与底物或PPO的其他部分结合来抑制酶活性，而这2种结合方式应该都是可逆的，且存在竞争关系，有待进一步的验证。

4 结论

相较于其他品种的茶树PPO，勐库大叶种茶树PPO粗酶的最适反应pH和最适反应温度均较低，有利于茶黄素和茶红素等成分的形成与积累，这可能与勐库大叶种茶树适制红茶的特性有关。勐库大叶种茶树PPO粗酶对焦性没食子酸的催化活性大于邻苯二酚，而对对苯二酚和间苯二酚几乎没有催化活性。勐库大叶种茶树PPO粗酶的最有效抑制剂为亚硫酸钠，而前人提取自槠叶齐、碧螺春、龙井43号等茶树品种PPO粗酶的最有效抑制剂均为抗坏血酸。在本研究中，Na+、K+和Mg2+对勐库大叶种茶树PPO粗酶活性的影响与前人的研究结果高度一致，其中Na+表现出抑制作用，K+和Mg2+则表现出不同程度的促进作用。在本试验中，Cu2+对勐库大叶种茶树PPO粗酶活性有极强的促进作用，但综合本课题组以往的研究结果发现，添加Cu2+对勐库大叶种茶树PPO粗酶活性的影响与剂量的选择存在一定联系。不同茶树品种PPO酶学特性的差异可能是导致品种适制性的原因之一，这可能与其蛋白质结构相关。本文对勐库大叶种茶树PPO酶学特性的研究，有利于更好地对PPO活性进行调控，从而为红茶生产中的品质控制与茶黄素体外制备的条件优化提供理论依据。

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Characterization of crude polyphenol oxidase isolated from Camellia sinensis var.assamica cv.Mengku.Journal of Zhejiang University(Agric.&Life Sci.),2017,43(5):579-588

WU Mengyao,HUANG Yingjie,YAO Yanni,HUANG Youyi*
(Ministry of Education Key Laboratory of Horticultural Plant Biology/Department of Tea Science,College of Horticulture and Forestry Sciences,Huazhong Agricultural University,Wuhan 430000,China)

Camellia sinensis var.assamica cv.Mengku;crude polyphenol oxidase;enzymatic characterization

S 571.1

A

10.3785/j.issn.1008-9209.2017.02.121

Summary Polyphenol oxidase(PPO,EC 1.10.3.1)has great significance to the growth and development of Camellia sinensis,for instance it participates in adjusting and maintaining the normal physiology and metabolism,plays an essential role in the course of the quality formation of tea products,and contributes to the oxidation reaction of tea polyphenols.The oxidation products,such as quinines,theaflavins and thearubigins,have a remarkable effect on the quality of black tea.The existing researches of C.sinensis PPO involve in various varieties and multiple aspects,including separation and purification,enzymatic property analysis,genetic structure,etc.Nevertheless,there is no research on C.sinensis var.assamica cv.Mengku,even though it carries relative original genetic information and has a great suitability for black tea manufacture.

In this study,the fresh leaves of Camellia sinensis var.assamica cv.Mengku were used as materials.The crude polyphenol oxidase(PPO)from tea leaves was extracted by using homogenate extraction technology and purified through(NH4)2SO4precipitation.The characteristics including optimum reaction pH,optimum reaction temperature,substratespecificity,Michaelis-Menten constants and the effect of inhibitors and metal ions on its activity were studied.It aims to lay the foundation for regulating PPO activity and illuminating the suitability for black tea manufacture of C.sinensis var.assamica.

国家自然科学基金（31270731）。

黄友谊（http://orcid.org/0000-0001-5735-2830），E-mail:youyi@mail.hzau.edu.cn

（First author）：伍梦瑶（http://orcid.org/0000-0001-8577-5304），E-mail:1062684346@qq.com

2017-02-12；接受日期（Accepted）：2017-05-03

The results showed that the optimum pH of crude PPO was 4.4,and its optimum temperature was 37℃.It had the catalytic activity on catechol and pyrogallic acid,but not on hydroquinone and resorcinol.When pyrogallic acid and catechol as its substrate,their Kmvalues were 4.2 and 36.5 mmol/L,respectively,and their Vmaxvalues were 2 000 and 5 000 U/mL,respectively,indicating that the catalytic efficiency of pyrogallic acid was better.The inhibition of EDTA-2Na,sodium sulfite,ascorbic acid and L-cysteine on crude PPO was enhanced with the increasing concentration,and sodium sulfite had the strongest inhibitory effect on it,while EDTA-2Na showed the lowest inhibitory rate,with 3.64%in 1.00 mmol/L.In this experimental condition,citric acid showed no inhibitory effect on crude PPO,on the contrary its activity was slightly increased(P＞0.05).Na+had inhibition action on the crude PPO,whereas both K+and Mg2+showed a promotion effect on the crude PPO.Cu2+of 10 mmol/L increased the enzymatic activity of crude PPO to 172.85%,which shows that Cu2+has a strong promotion effect on the crude PPO.

In conclusion,the relative lower optimal pH and optimum reaction temperature of the crude PPO are advantageous to the formation of main quality components in black tea,particularly the formation of theaflavins,which may account for that C.sinensis var.assamica cv.Mengku is fit to manufacture black tea.The characteristics of the crude PPO,which was extracted and purified from C.sinensis var.assamica cv.Mengku,show visible differences with other varieties.This may be caused by discrepancy of protein structure,and lead to suitability for manufacture of tea varieties.