秀珍菇不同生长发育阶段蛋白质组学分析

王伟科，袁卫东，方献平，宋吉玲，闫静，陆娜

秀珍菇不同生长发育阶段蛋白质组学分析

王伟科1*，袁卫东1，方献平2，宋吉玲1，闫静1，陆娜11

（1.杭州市农业科学研究院蔬菜研究所，杭州310024；2.杭州市农业科学研究院生物技术研究所，杭州310024）

为了解秀珍菇生长发育各阶段蛋白质组的差异，对秀珍菇菌丝生长期、原基期、珊瑚期及子实体成熟期4个不同阶段的表达蛋白进行比较蛋白质组学分析。结果表明：与最初的菌丝生长期相比，其余3个不同发育时期共筛选得到885个差异表达蛋白，原基期、珊瑚期和子实体成熟期分别有差异表达蛋白376、642及692个；这4个阶段特异表达的蛋白分别为11、23、136和181个。基因本体注释结果显示，分别有26%、20%、15%和11%的差异蛋白参与糖类合成、生殖结构发育、器官合成和蛋白大分子代谢等生物学过程；代谢通路分析表明，差异表达蛋白显著富集在三羧酸循环和糖酵解/糖异生途径2条代谢通路上，这些通路的改变很有可能在秀珍菇的生长发育过程中起着重要作用。研究还发现，参与胞内应激修复过程的HSP70蛋白在不同阶段发生显著差异表达变化，提示分子伴侣类热激蛋白对调控秀珍菇生长发育具有重要意义。

秀珍菇；生长期；蛋白质组学

食用菌的生长发育过程极为复杂，在不同的生长发育阶段受新陈代谢、营养物质合成及转运、细胞分裂及分化、激素调控、信号转导等多个代谢途径的协同作用[1]。了解食用菌的生长发育机制对其遗传育种和栽培技术的研究具有重要指导意义，因此，食用菌尤其是可食用担子菌子实体的形态建成一直是研究的重点。

蛋白质组学技术已经成为当今生命科学领域的研究热点，是生物学中破译基因功能、服务育种程序及提高作物品质的重要途径[2]。目前，蛋白质组学技术在食用菌研究中的应用还处于起步阶段，主要涉及食用菌不同生长发育阶段、不同组织形态阶段等遗传机制和逆境胁迫下差异表达蛋白的研究[3]，研究品种主要集中在双孢蘑菇（Agaricus bisporus）[4]、金针菇（Flammulina velutipes）[5]、斑玉蕈（Hypsizigus marmoreus）[6]、灵芝（Ganoderma lucidum）[7]等。而利用蛋白质组学技术开展珍稀食用菌秀珍菇（Pleurotus pulmonarius）的生长发育机制研究尚未见报道。

秀珍菇隶属于担子菌纲、伞菌目、侧耳科、侧耳属，其生长发育过程包含营养生长和生殖生长2个阶段。秀珍菇菌丝体在适宜的养分和环境条件下逐渐达到生理成熟形成原基，并进一步分化成为成熟的子实体[8]。这一系列生理过程除了受栽培环境、基质营养成分等外在因素的影响外，主要还由其自身的遗传因子所决定，即通过调控相关基因的表达来编码蛋白质表达，从而指导完成复杂的生理过程。因此，本文研究了秀珍菇不同生长阶段的差异表达蛋白，探讨了其生长发育过程中菌丝生长、原基形成分化及子实体的建成机制，从而进一步揭示秀珍菇生长发育的分子机制，为加快其遗传育种过程奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

供试秀珍菇菌株“台秀5766”由浙江临安鼎新生物科技有限公司提供。4个生长发育阶段，即菌丝体阶段（S1）、原基形成期（S2）、珊瑚期（S3）和子实体成熟期（S4）的秀珍菇均采自杭州市农业科学研究院蔬菜研究所菌种站大棚。菌包基质配方为棉籽壳30%，木屑54%，麸皮15%，石灰1%。

1.2 秀珍菇蛋白的提取及定量

称取每个阶段新鲜秀珍菇材料1 g，在液氮中研磨成细粉，分装入1.5 mL离心管中，加入1 mL蛋白质提取液Ⅰ（含10%三氯乙酸和0.07%β-巯基乙醇的丙酮溶液）沉淀粗蛋白（－20℃，1 h），然后于4℃、1.3万r/min下离心20 min。再加入相同体积蛋白提取液Ⅱ（含0.07%β-巯基乙醇的丙酮溶液）悬浮粗蛋白（－20℃，1 h），然后于4℃、1.3万r/min下离心20 min。弃上清液，将沉淀用蛋白提取液Ⅱ悬浮清洗2次（－20℃，1 h），真空抽干得粗蛋白粉。准确称取50 mg粉末，加入1 mL裂解液（8 mol/L尿素、10 mmol/L二硫代苏糖醇、2 mmol/L乙二胺四乙酸和1 mmol/L苯甲基磺酰氟）中，振荡混匀，在4℃静置1 h，期间取出振荡3～5次，然后在20℃、1.3万r/min下离心15 min，取上清液。用Bradford法蛋白定量后分装并保存于－80℃备用。

1.3 蛋白溶液内酶解与除盐

取约100 μg蛋白样本进行酶解：加入10 mmol/L二硫代苏糖醇（Sigma公司，美国），56℃还原反应1 h；冷却至室温后，加入50 mmol/L碘乙酰胺（Sigma公司，美国），避光反应45 min；再加入10%三氯乙酸（Sigma公司，美国），4℃沉淀2 h；然后用冷丙酮洗后离心得沉淀颗粒，溶于100 mmol/L NH4HCO3中，超声5 min；按酶与蛋白质量比1∶50加入胰蛋白酶，37℃反应12 h。酶解后的肽段除盐后真空干燥。

1.4 液质鉴定与差异蛋白相对定量分析

真空干燥后的肽段用含0.1%甲酸的水溶液复溶至0.5 μg/μL，每组分上样4 μL（约2 μg蛋白）。采用纳升级EASY-nLC 1000液相和Q-Exactive高分辨率质谱联用系统（Thermo Fisher公司，美国）的液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS）法对各个时期的样品肽段进行鉴定。流动相A液：含0.1%甲酸的水溶液；B液：含0.1%甲酸的乙腈。线性洗脱梯度（B液）：1%～40%，120 min；40%～65%，5 min；65%，保持5 min；65%～1%，1 min；1%，20 min平衡。流速为200 nL/min。Q-Exactive质谱扫描范围为350～1 800（m/z），每个一级谱图自动选择3个最强母离子进行二级扫描。每个时期进行3次生物学重复。

鉴于秀珍菇为非模式生物，基因组序列未完全可知，所以利用分类学上级近缘物种伞菌目（Agaricales）数据库进行同源搜库比对。搜库鉴定软件为Proteome Discoverer 1.4（Thermo Fisher公司，美国），并借助Sieve 2.2软件（Thermo Fisher公司，美国）对差异表达的蛋白谱峰强度加以对比，进行非标记相对定量（p＜0.05）。

1.5 生物信息学分析

利用Uniprot蛋白数据库（http://www.ebi.uniprot.org）对所鉴定到的蛋白质进行基因本体（gene ontology,GO）注释，依据蛋白质参与的生物学过程、细胞学组分和分子功能属性，以S1期为对照，对秀珍菇不同生长发育时期出现的差异蛋白分别进行GO分析。利用KEGG网络信号数据库（http://www.genome.jp/kegg/pathway.html）对鉴定到的差异蛋白进行匹配，挖掘秀珍菇在发育过程中由差异蛋白表达变化导致发生改变的重要代谢信号通路（p＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 不同生长发育阶段秀珍菇的形态学观察

秀珍菇菌丝生长期（S1）培养条件为（26±2）℃，避光；待菌丝发满菌袋并后熟培养50 d，再将菌包在5℃下放置12 h，然后移入温度为（30±2）℃的菇棚，1～2 d后形成原基（S2）；经16～20 h进入珊瑚期（S3）；再经6～8 h即为秀珍菇子实体成熟期（S4）。取S1、S2、S3和S4期（图1）生长发育状态良好的样品用作后续实验。

图1 秀珍菇4个生长发育阶段的形态特征Fig.1 Morphological characteristics of four different growth phases of Pleurotus pulmonarius

2.2 秀珍菇不同生长发育阶段蛋白质组变化

对秀珍菇4个生长发育阶段的蛋白数进行鉴定。结果（图2）显示：不同生物学重复间具有很好的重复性；根据每个阶段3次重复实验中至少2次鉴定到同一蛋白的原则，总共同源鉴定到秀珍菇菌丝生长期、原基形成期、珊瑚期和子实体成熟期的蛋白数分别为962、1 165、1 338和1 434个。

通过Uniprot蛋白注释和Sieve 2.2软件对差异表达的蛋白谱峰强度进行对比和非标记相对定量。结果（表1）显示，以S1为对照，在S2、S3和S4中鉴定到的差异表达蛋白分别为376、642和692个，分别占鉴定到的蛋白总数的22.1%、37.8%和40.8%。除去重复蛋白数，共有885个蛋白与S1相比至少在1个阶段的差异表达倍数达到1.5倍以上（p＜0.05），其中上调表达的蛋白742个，下调表达的蛋白143个；差异表达倍数达3倍以上（p＜0.01）且在3次重复实验中（图2）都被鉴定到的高可信蛋白有46个（附表1，http://www.zjujournals.com/agr/EN/article/showSupportInfo.do?id=10508）。

图2 秀珍菇4个生长发育阶段3次重复实验鉴定到的蛋白数Fig.2 Number of proteins identified from four different phases of P.pulmonarius with three biological replicates

表1 4个生长发育阶段鉴定到的总蛋白及差异蛋白数Table 1 Number of total identified proteins and differential proteins in four different phases

从图3A中可以看出：有789个蛋白在4个生长发育阶段中均被鉴定到，而只在1个阶段中出现的特异表达蛋白共351个，对应到各阶段分别有11、23、136和181个（图3A，表2）；其中涉及生殖发育和糖类合成的特异表达蛋白数量分别占总特异表达蛋白的23.9%和21.9%。由图3B可知，大部分蛋白等电点（pI）为4～12，分子质量聚集在10～100 kDa之间。

2.3 差异蛋白GO注释功能分析

对885个变化1.5倍以上的差异表达蛋白进行GO功能注释发现，在差异表达蛋白参与的相关生物学过程中，分别有26%、20%、15%和11%的蛋白与糖类合成、生殖结构发育、器官合成和蛋白大分子代谢相关（图4A）。经细胞组分分析发现，差异表达蛋白主要富集在线粒体（29%）、细胞核（15%）和内质网（13%）3大区域（图4B）。由于大量蛋白质的合成变化往往需要核蛋白复合物、内质网和线粒体的协同作用，因此推测这很可能与秀珍菇原基分化形成子实体过程中大量蛋白质合成变化相关。同时，对差异表达蛋白的分子功能聚类发现，21%的蛋白具有转移酶活性，15%的蛋白具有水解酶活性（图4C）。

图3 秀珍菇4个生长发育阶段蛋白质组鉴定概况Fig.3 Preliminary proteomic analysis of four different phases of P.pulmonarius

表2 4个生长发育阶段鉴定到的特异表达蛋白数及功能分类Table 2 Number of specifically expressed proteins and function class in four different phases

2.4 秀珍菇不同生长发育阶段的差异表达蛋白参与的代谢通路

885个变化1.5倍以上的差异表达蛋白不但广泛参与了众多的生物学过程，而且还行使着诸多不同的分子生物学功能。KEGG注释结果表明，差异表达蛋白主要参与了三羧酸循环（图5）和糖酵解/糖异生途径（图6）2条代谢通路。可见，这些通路的改变可能对秀珍菇的生长发育过程起着重要作用。

3 讨论

图4 秀珍菇885个差异表达蛋白GO功能注释情况Fig.4 GO analysis of 885 differentially expressed proteins of P.pulmonarius

图5 秀珍菇发育过程中差异表达蛋白参与的三羧酸循环Fig.5 Differentially expressed proteins of P.pulmonarius involved in the tricarboxylic acid(TCA)cycle

图6 秀珍菇发育过程中差异蛋白参与的糖酵解/糖异生途径Fig.6 Differentially expressed proteins of P.pulmonarius involved in the glycolysis/gluconeogenesis pathway

生物体在不同生长发育阶段的蛋白质组会发生变化，这些不同的蛋白质组是构成生物体某一时刻特征性生命活动的基础，是认识生物体生命活动本质的直接途径[9]。蛋白质组学研究旨在建立不同时间与空间的生物组织细胞所有表达蛋白质的动态表达谱，不仅能为生命活动规律提供物质基础，也能为生物体遗传育种提供理论根据和解决途径。通过对不同生长发育阶段食用菌蛋白质组进行比较分析，我们可以找到某些“特定生长发育阶段特异性蛋白质分子”，它们可成为遗传育种的靶向效应蛋白，有利于揭示内外环境对生物机体生长发育的影响机制，在食用菌乃至作物的遗传育种中都具有重要意义。因此，我们运用蛋白质组学技术对秀珍菇生长发育过程中动态变化的蛋白质进行了研究。

本研究对秀珍菇商业菌株“台秀5766”的4个生长发育阶段，即菌丝生长期、原基形成期、珊瑚期和子实体成熟期的样品肽段进行了LC-MS/MS分析，共鉴定到885个具有相对定量信息的差异蛋白，这些差异蛋白的功能主要涉及糖类合成、生殖结构发育、器官合成和蛋白大分子代谢等。本研究还发现，秀珍菇4个生长发育阶段的特异表达蛋白数随着发育进程而增加，且29.3%的特异表达蛋白与生殖发育相关。这说明这些特异表达蛋白很可能参与了秀珍菇子实体生殖器官的形态建成，但其具体生理功能还有待进一步研究。KEGG分析发现，参与三羧酸循环和糖酵解/糖异生途径这2个不同代谢通路的差异蛋白显著富集，提示这些差异蛋白引发的这2条代谢通路的改变可能对秀珍菇的生长发育过程起着重要作用。

本研究还鉴定到在4个生长发育阶段中差异表达的46个高可信蛋白。通过Uniprot蛋白注释发现，近17%的蛋白参与了胞内应激修复过程，包括热休克蛋白70（heat shock protein 70），细胞分裂控制蛋白 3（cell division control protein 3），septin基因家族4（spn4）等。其中热休克蛋白70由应激诱导产生，参与胞内应激修复，其主要生物学功能之一是作为分子伴侣，在胞内帮助其他多肽进行正确的折叠、组装、运转和降解[10]，可能对秀珍菇子实体的正常发育起着重要作用。研究表明，植物中HSP70的表达受到多种非生物胁迫的诱导，如高温[11]、低温[12]、干旱[13]等，也与植物个体生长发育相关[14-15]。过表达HSP70可提高植物对高温的耐受性已得到研究证实[16]。本研究发现，HSP70在4个生长发育阶段的变化显著，推测可能与秀珍菇不同生长阶段受温度刺激有关。今后可深入研究HSP70基因家族成员的功能，为秀珍菇抗逆品种的选育提供参考。

本研究获得了秀珍菇4个生长发育阶段的差异表达蛋白，以菌丝生长期为对照，将其余3个生长发育阶段共885个差异表达蛋白与之进行了初步比较研究。后续将进一步对相邻阶段的差异表达蛋白进行比较，以及对各阶段特异表达的蛋白质进行筛选和功能验证，并结合秀珍菇对应阶段的转录组学测序分析，开展mRNA和蛋白质在表达量和表达趋势上的相关性研究。本研究初步探讨了秀珍菇菌丝生长、原基形成与分化、子实体成熟的分子机制，逐步解析了秀珍菇生长发育过程中遗传、生理生化等变化规律，对秀珍菇育种及栽培技术研究具有重要的指导意义。

4 结论

本研究分析了秀珍菇在生长期、原基形成期、珊瑚期和子实体成熟期4个不同生长发育阶段蛋白质组的表达变化，发现了不同生长发育阶段之间的差异信号响应通路及差异表达蛋白，说明这些差异表达蛋白在秀珍菇子实体形态建成及抵抗不良环境等方面起到了非常重要的作用。本研究结果也为解析秀珍菇生长发育过程中遗传、生理生化及生物学特性等方面的研究提供了参考。这有利于揭示内外环境对秀珍菇机体生长发育的影响，为进一步深入研究秀珍菇机体生长发育机制提供了支撑，也为后续秀珍菇育种及相关栽培技术研究奠定了理论基础。

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Comparative proteomics analysis of Pleurotus pulmonarius at different developmental phases.Journal of Zhejiang University(Agric.&Life Sci.),2017,43(5):527-535

WANG Weike1*,YUAN Weidong1,FANG Xianping2,SONG Jiling1,YAN Jing1,LU Na1
(1.Institute of Vegetables,Hangzhou Academy of Agricultural Sciences,Hangzhou 310024,China;2.Institute of Biology,Hangzhou Academy of Agricultural Sciences,Hangzhou 310024,China)

Pleurotus pulmonarius;growth period;proteomics

S 646；S 353；Q 51

A

10.3785/j.issn.1008-9209.2016.12.191

Summary It is important to investigate the mechanism of growth and development of edible fungi for genetic breeding and cultivation technique research.Based on the total expressed proteins of biological tissues and cells,a protein expression profile can be established by using proteomics technology,which can not only provide a material basis for the law of life,but also provide a theoretical basis and solution for biological genetic breeding.

In this study,in order to analyze the protein expression changes at different developmental phases and explore the law of growth and development of Pleurotus pulmonarius,we applied an integrated proteomic approach to comprehensively investigate the proteome change of P.pulmonarius at different developmental phases,including mycelium phase,primordium phase,coral-like phase,and fruit body phase,by using high-sensitive-mass spectrometer.

The results showed that,compared with the initial mycelium growth phase,a total of 885 differentially expressed proteins were isolated from the other three growth phases,with 376,642 and 692 differentially expressed proteins from the primordium phase,coral-like phase and fruit body phase,respectively.The specifically expressed proteins were 11,23,136 and 181 respectively in the four different developmental phases.Gene ontology annotation showed that 26%,20%,15%and 11%of the differentially expressed proteins were related with carbohydrate synthesis,reproductive structuredevelopment,organ synthesis and protein metabolism.Moreover,the analysis of metabolic pathway showed that the differentially expressed proteins mainly involved in the pathway of tricarboxylic acid cycle and glycolysis/gluconeogenesis which may possibly play an important role in the growth and development of P.pulmonarius.The heat shock protein 70(HSP70),belonging to a molecular chaperone,showed significant differences in mycelium phase,primordium phase,corallike phase,and fruit body phase,indicating that it is critical to regulate the growth of P.pulmonarius.

浙江省农业（食用菌）新品种选育重大科技专项（2016C02057）；杭州市科技发展计划项目（20150932H06）。

王伟科（http://orcid.org/0000-0002-2228-6519），E-mail:akeok@126.com

（

）:2016-12-19；接受日期（Accepted）:2017-03-13

In conclusion,there are differentially expressed proteins and differential signaling pathways at different developmental phases of P.pulmonarius.These differentially expressed proteins play a very important role in the organic development,fruiting body morphogenesis and resistance to adverse environmental conditions.This study lays a theoretical basis for the research of breeding and cultivation techniques of P.pulmonarius.