广州地区桑椹菌核病病原鉴定

黄志君，易辉玉，李荣俏，李林山

（1.华南农业大学动物科学学院，广东 广州 510642；2.广东省蚕业技术推广中心，广东 广州 510640）

广州地区桑椹菌核病病原鉴定

黄志君1，易辉玉1，李荣俏1，李林山2

（1.华南农业大学动物科学学院，广东 广州 510642；2.广东省蚕业技术推广中心，广东 广州 510640）

桑椹菌核病是目前危害桑椹的主要真菌性病害，在广州地区桑园一直都有发生，由多年前主要发生的肥大性菌核病变成小粒性菌核病，其菌核表面为大量的分生孢子和一些分生孢子梗，里面为相互交叉致密的菌丝，培养后的菌核周围形成一层白色半透明的菌圈。使用真菌通用引物，由桑椹菌核病病果的菌核DNA扩增ITS，测序后进行Nucleotide BLAST和进化分析，发现其与4种桑椹菌核病病原菌中的肉阜状杯盘菌（Ciboria carunculoides）序列相似度最高、亲缘关系最近，确认该小粒性桑椹菌核病病原为肉阜状杯盘菌。

桑椹菌核病；桑椹小粒性菌核病；形态鉴定；核糖体内转录间隔区

桑椹，俗称桑果，是长椭圆形聚合果，富含果汁，清甜可口，并具有极高的保健和药用价值，被列为世界第3代水果，具有广阔的开发利用前景。桑椹含有丰富的果糖、葡萄糖、丁二酸、无机盐、7种维生素和人体所需的氨基酸等多种营养成分，也含有抗坏血酸、花青素（主要为矢车菊素）、白藜芦醇和微量元素等活性成分［1-3］。桑椹除鲜食外，还可以制成桑椹酒、桑椹蜜饯、桑椹饮料等保健食品［4］。随着人们生活水平的提高和追求高品质水果及饮品，桑椹及桑果汁越来越受到人们的青睐；果桑的种植面积迅速发展，成为蚕桑产业发展的一个新亮点。当前正是果桑发展方兴未艾之期，2016年广东果桑种植面积已达1 500 hm2。但是，随着果桑种植面积的扩大，桑椹的毁灭性病害——桑椹菌核病也在不断蔓延，该病传染性极强、危害性大，直接影响桑椹的产量和质量，发病严重时可导致全园桑椹绝收，给果桑产业带来毁灭性的危害［5］。

桑椹菌核病为真菌性病害，俗称白果病，常见有桑椹肥大性菌核病（mulberry sorosus hypertrophic sclerote disease）、桑椹小粒性菌核病（mulberry sorosus parvulling sclerote disease）和桑椹缩小性菌核病（mulbery sorosus diminuting sclerote disease）3种。在国外，20世纪20年代Siegler与Jenkins就对桑椹小粒性菌核病的病原进行了鉴定［6-7］；之后，在美国、日本和印度等国家都有桑椹菌核病相关的研究与报道［8-10］。Hong等通过对韩国果桑地的菌核进行培养鉴定，发现了在当地发生的两种菌核病菌——核盘菌与核地杖菌，并对它们的形态进行深入研究［11］。蒯元璋等对常见且公认的3种桑椹菌核病（桑椹肥大性菌核病、桑椹小粒性菌核病和桑椹缩小性菌核病）及它们的病原桑实杯盘菌（Ciboria shiraiana）、肉阜状杯盘菌（Ciboria carunculoides）和核地杖菌（Scleromitrula shiraiana）的形态特征进行详细的描述［5］。胡君欢等结合形态与分子鉴定，发现宁波天宫庄园桑果观赏基地的菌核病菌除公认的3种外，还有核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）［12］。

桑椹小粒性菌核病除直接危害桑果外，还会交叉感染桑树其他组织，引起桑枝菌核病（断梢病）的严重发生。据蓝月丘等报道，2007年5月广西宜州市部分桑园暴发断梢病，严重桑园发病率达80%～100 %，造成桑枝倒伏和干枯，桑叶减产60 %以上，给当地桑蚕带来极大损害［13］。2014年4月华南农业大学桑园桑枝菌核病（断梢病）引起桑树伦40品种严重倒伏。根据对广州桑椹菌核病的调查，近年该地区的桑椹菌核病主要为小粒性菌核病，但该菌核病是否有地理的特异性及病原是否有分化尚未有具体的研究。因此，本试验对华南农业大学桑园桑菌核病病原菌的形态和分子进行鉴定，为对其进行对症下药和有效防控提供基础和理论支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料：在华南农业大学桑园中采集桑椹菌核病病椹典型样本2份，编号为gz01和gz02，用于直接进行形态学研究或-20 ℃冰箱保存备用。

试验试剂：2 × Ace Taq Master Mix（Dye Plus）和DL2000 Plus DNA Marker，购自南京诺唯赞生物科技有限公司。

培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）。

1.2 形态学研究

对采集的桑椹菌核病病椹菌核进行切片观察，并刮取菌核表面菌丝与孢子，进行碘液染色，乳酚油作浮载剂制片，光学显微观察病原的形态特征。

对菌核进行PDA培养，观察菌丝与孢子形态。选择新鲜菌核，切成大小3～4 mm2组织块；将材料浸入75%酒精中2～3 s，再转入0.1%升汞液处理0.5～2 min；然后经无菌水清洗3次；用吸水纸吸干移入平板培养基上。每培养皿放置3～5块材料，将培养皿翻转置于25℃恒温箱内培养。当培养组织块长出菌丝，用移植针挑取边缘菌丝制片观察。

1.3 ITS分子鉴定

总DNA提取：将菌核放入2 mL离心管中，在全自动低温组织匀浆仪上打碎后，用植物基因组DNA提取试剂盒提取总DNA。

rDNA-ITS扩增：用真菌ITS（核糖体内转录间隔区，Internal Transcribed Spacer）的通用引物 ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和 ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）对菌核总DNA进行PCR扩增。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反应体系（50 μL）：2 × Ace Taq Master Mix 25 μL；引物各1 μL；模板DNA 2 μL；加ddH2O至总体积为50 μL。PCR反应条件：95℃热变性5 min；95℃变性 30 s，60℃退火 30 s，72℃延伸45 s，此3步进行35个循环；最后72℃延伸5 min。反应终止后，取5 μL产物用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，120 V，电泳30 min。将有目的条带的PCR产物送往生工生物工程（上海）股份有限公司进行纯化和测序。

序列比对与系统发育树的构建：将测得的序列在NCBI上进行BLAST分析，选取并下载相关序列与目的序列一起进行系统进化分析。使用软件MEGA 7.0，先采用ClustalW对所有序列进行多序列比对分析，对位排列两段对齐后，采用邻接法（Neighbor-Joining，NJ），通过自举分析（bootstrap）进行置信度检测，自展次数为1 000，用Kimura 2-parameter计算进化距离，构建系统进化树。

2 结果与分析

2.1 桑椹小粒性菌核病形态

病椹病征显现初期，病椹仍呈正常淡紫红色，但感病小果不断膨大，颜色变淡，接着子房壁和花被由里到外逐渐变得透明，然后变白，而柱头和萼片边缘深褐色，最后整个病椹变白（图1A、C，封三），病小果呈相互分隔澎大状，容易掉落（图1A，封三）。如果遇到雨水天气，有的病椹变褐变黑，甚至腐烂（图1B、D，封三）。如营养水分不足，病椹小果会显得干枯和松散（图1C，封三）。随着病椹变白的过程，由病小果形成的菌核也不断形成，剥开外层花被，可见由子房病变而成的黑色硬块—桑椹小粒性菌核病菌核（图2A，封三）。刮取菌核表面菌物质观察，可见大量的分生孢子以及一些分生孢子梗，孢子大小约2～3 μm，孢子梗呈分叉状（图2B，封三），对菌核进行切片观察，可见里面相互交叉致密的菌丝（图2C、D，封三）。

图1 桑椹菌核病（白果病）形态

图2 桑椹小粒性菌核病菌核、孢子及菌核切片形态

通过对菌核的培养，发现在菌核周围可形成一层白色半透明的菌圈（图3A，封三），挑取菌落边缘菌物进行显微观察，发现其菌丝密集，菌丝多断裂成小段，上面也存在着较多的分生孢子（图3B，封三）。但通过培养没有看到分生孢子的萌发（图3B，封三）。

图3 桑椹小粒性菌核病菌核培养的菌落、菌丝和孢子形态

2.2 ITS扩增产物的电泳检测

由桑椹小粒性菌核病病果的菌核（gz01和gz02）提取总DNA，以它们为模板，用真菌通用引物ITS1和ITS4扩增得到ITS片段，琼脂糖凝胶电泳检测结果（图4）显示，由菌核gz01和gz02扩增得到的ITS片段大小相近，条带位于500～750 bp之间，与真菌通用引物扩增的条带大小（550 bp左右）相符。将扩增得到的两条ITS产物送生工生物工程（上海）股份有限公司纯化后进行测序。

图4 ITS扩增产物琼脂糖凝胶电泳

2.3 ITS序列及其发育树的构建

序列比对发现，由gz01和gz02扩增并测序的两条ITS片段只有3个碱基的差异。在NCBI网站上对它们分别进行Nucleotide BLAST分析，所测得的两条ITS序列与多株Ciboria carunculoides菌株的ITS序列均有99%的相似性，与3株Ciboria shiraiana菌株的ITS序列有约90%的相似性，而与其它桑椹菌核病病原如Scleromitrula shiraiana的ITS序列则相似性较低。

根据BLAST结果，将所测得的两条序列与NCBI登录的桑椹菌核病病原ITS序列进行系统进化分析（图5），4种桑椹菌核病的病原—桑实杯盘菌（Ciboria shiraiana）、肉阜状杯盘菌（Ciboria carunculoides）、核地杖菌（Scleromitrula shiraiana）和核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）均各成分支，Scleromitrula shiraiana与非桑椹菌核病病原—柔膜菌目真菌Cadophora melinii处于一支；其中Ciboria carunculoides和Ciboria shiraiana的亲缘关系较近，Sclerotinia sclerotiorum和Scleromitrula shiraiana的关系较近。本实验研究的桑椹菌核病病原（gz01和gz02）与Ciboria carunculoides同源性最近。

图5 桑椹菌核病病原菌系统进化分析

3 结论与讨论

在植物病原分类鉴定方面，由于植物病原菌形态特征复杂，有些病原菌的形态特征和生理生化指标受环境等外界因素影响而不稳定，传统的植物病原分类鉴定常引起分类系统的混乱或意见分歧。用于未知菌分类鉴定的核酸序列分析最常选用的是真菌核糖体脱氧核糖核酸（rDNA），rDNA序列保守性强，存在可变区和高变区。真菌基因组中编码核糖体的基因包括28S、5S、18S和5.8S rDNA，它们在染色体上头尾相连而串联排列，相互之间由间隔区分隔；间隔区ITS1和ITS2是位于核糖体大小亚基基因之间的核苷酸序列，通过利用通用引物对间隔区ITS1和ITS2进行克隆及测序分析，可以在种及亚种水平上进行真菌的鉴定［14］。以PCR为基础的ITS序列分析技术在植物病虫害的研究上取得了突破性的进展［14-15］。

目前，国内对桑椹菌核病分子水平的研究才刚刚起步，其将是未来重要的研究方向。一般认为桑椹菌核病包括桑实杯盘菌、肉阜状杯盘菌和核地杖菌3种病原菌，但越来越多的研究表明桑椹菌核病病菌存在多样性，近年来在形态鉴定的基础上结合分子鉴定确认其他病原菌如核盘菌等的存在［12，17-18］。贺磊等从发病桑椹上分离纯化出一株真菌，结合形态学和分子生物学鉴定，确定此菌株为一种桑椹致病菌—桑茎点霉（Phoma moricola）［16］。李如等从表现桑椹菌核病病症的桑树病果中分离到一株优势真菌菌株，其在PDA平板上培养的菌落外观特征与在染病桑椹小核果间菌丝发育形成的菌核病菌类似，结合rDNA -ITS检测分析，初步鉴定该菌株属于拟茎点霉［17］。对华南农业大学桑园桑菌核病病原菌的形态和分子进行鉴定发现其病原菌主要为肉阜状杯盘菌，表现为小粒性菌核病；但因取材的限制性，对其多样性还有待进一步的调查和研究。

另外，在病原侵染上，一般认为桑椹菌核病菌的子囊孢子成熟喷发形成初次侵染，加上形成病椹后产生大量分生孢子形成再次侵染，侵染期长达1个多月；但我们调查发现，在广州地区，桑椹菌核病在后开花桑果中的为害较早开花的轻，这与分生孢子形成再次侵染的说法不相符；而且，我们对分生孢子进行PDA、燕麦等培养基培养均不能使孢子萌发。张重梅对油菜的4株核盘菌的研究也发现，在培养基中不能使核盘菌的分生孢子萌发［18］。因此，对桑椹菌核病分生孢子的侵染功能与机制有待进一步研究。

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Morphological and molecular identification of mulberry fruit sclerotiniose pathogen in Guangzhou

HUANG Zhi-jun1，YI Hui-yu1，LI Rong-qiao1，LI Lin-shan2

（1. College of Animal Science，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China；2. Guangdong Sericulture Technology Extension Center，Guangzhou 510640，China）

Mulberry fruit sclerotiniose is the major fungal disease and becomes a serious threat to mulberry production. It often occurs in mulberry field of Guangzhou areas. And the harmful symptoms show that the major disease may change from mulberry sorosus hypertrophic sclerote disease to mulberry sorosus parvulling sclerote disease. In order to identify the pathogens of this disease，its morphological features were identified and the results showed that the suface of sclerotium had lots of conidia with some conidiophores and there were full of intersecting hyphae inside. When cultured on PDA media，a white and translucent zone was formed around the sclerotium.Moreover，the ITS conserved sequences of mulberry sorosus parvulling sclerote were analyzed and the results showed that the pathogen of mulberry sorosus parvulling sclerote disease wasCiboria carunculoides.

mulberry fruit sclerotiniose；mulberry sorosus parvulling sclerotiniose；morphological identification；internal transcribed spacer（ITS）

S888.71

A

1004-874X（2017）07-0091-05

黄志君，易辉玉，李荣俏，等. 广州地区桑椹菌核病病原鉴定［J］.广东农业科学，2017，44（7）：91-95.

2017-04-22

广东省协同创新与平台环境建设项目（2015-09-11）

黄志君（1971-），男，博士，高级实验师，E-mail：hzj@scau.edu.cn

易辉玉（1981-），女，博士，讲师，E-mail：yihy@scau.edu.cn

（责任编辑 杨贤智）