无籽刺梨与野生刺梨果实的氨基酸含量及组成

林 陶，李婕羚，付远洪，杨卫灵

(1. 贵州师范大学 贵州省山地环境信息系统与生态环境保护重点实验室，贵州 贵阳 550001；2. 贵州医科大学 食品安全学院，贵州 贵阳 550001)

无籽刺梨与野生刺梨果实的氨基酸含量及组成

林 陶1，李婕羚1，付远洪1，杨卫灵2*

(1. 贵州师范大学 贵州省山地环境信息系统与生态环境保护重点实验室，贵州 贵阳 550001；2. 贵州医科大学 食品安全学院，贵州 贵阳 550001)

为更深入的研究和开发利用贵州无籽刺梨和刺梨资源，本研究采用盐酸水解法，以正亮氨酸为内标物，异硫氰酸苯酯(PITC)为柱前衍生剂，用高效液相色谱测定无籽刺梨与野生刺梨的氨基酸的含量，对其进行组成分析和营养评价。结果表明，三种果实样品均含有16种氨基酸，成熟无籽刺梨与刺梨比较，无籽刺梨的总氨基酸、必需氨基酸、儿童必需氨基酸、味觉氨基酸、药效氨基酸、支链氨基酸略高；氨基酸组成分析中，除了Cys+Met外，其它均符合WHO/FAO氨基酸模式谱。

高效液相色谱法；无籽刺梨；刺梨；氨基酸；营养评价

无籽刺梨(Rosa sterilis S. D. Shi)与刺梨(Rosa roxburghii Tratt)同属蔷薇科植物，为多年生落叶攀援性灌木，与广泛分布的刺梨相比，无籽刺梨是贵州特有种[1]。目前，关于这两种植物研究如总黄酮、维生素C、超氧化物歧化酶、单宁、挥发性香气成分测定，以及染色体、基因克隆及表达分析研究等已有部分报道[2-6]，而有关它们氨基酸方面的研究较少[8]。作为营养丰富的食材，刺梨已经广泛用于食品、药品行业；而无籽刺梨口感清香爽口，酸甜适度，被誉为“新山珍”[9]，是研究热门的药食两用植物之一。本研究采用异硫氰酸苯酯柱前衍生法，用高效液相色谱测定无籽刺梨和野生刺梨中的氨基酸组成及其含量，以期在其医疗保健、营养及新产品开发等领域，为进一步开发利用两种植物资源提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试药材

野生刺梨成熟果采集于9月份，无籽刺梨成熟果采集于11月，采集地点均为贵州省兴仁县。

1.1.2 仪器与试剂

Agilent 1200 高效液相色谱仪、DAD检测器、Agilent色谱工作站(安捷伦科技有限公司)，恒温干燥箱(金南仪器制造有限公司)，AL-204电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多)，旋转蒸发仪(日本ELYEA，N-1001)。

天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、丝氨酸(Ser)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、精氨酸(Arg)、苏氨酸(Thr)、丙氨酸(Ala)、脯氨酸(Pro)、酪氨酸(Tyr)、缬氨酸(Val)、蛋氨酸(Met)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)、赖氨酸(Lys)对照品(美国Sigma-Aldrich公司)；正亮氨酸(Nle)、PITC衍生剂、三乙胺(Bonna-Agela Technologies 公司)。乙腈(色谱纯，美国TEDIA公司)，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

Agilent 1200 HPLC, DAD检测器、Agilent色谱工作站(安捷伦科技有限公司)，恒温干燥箱(金南仪器制造有限公司)，AL-204电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多)，旋转蒸发仪(日本ELYEA，N-1001)。

1.2 方法

1.2.1 测定条件

色谱柱为Hypersil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，进样量2 μL，体积流量1 mL·L-1，柱温35 ℃，检测波长254 nm；流动相A为乙腈-0.1mol·L-1乙酸钠溶液-乙酸(7:93:0.05)，流动相B为乙腈-水(80:20)，梯度洗脱程序：3～15 min，0%～12%B；15～16 min，12%～24%B；16%～31 min，24%～30%B；31%～32 min，30%～60%B；32～40 min，60%～80%B。

1.2.2 氨基酸混合对照溶液制备

分别精密称取各氨基酸对照品适量，加0.1 mol·L-1盐酸溶液制成每毫升含天冬氨酸1.007 mg、谷氨酸1.073 mg、丝氨酸0.794 mg、甘氨酸0.694 mg、组氨酸0.740 mg、精氨酸0.973 mg、苏氨酸0.757 mg、丙氨酸0.744 mg、脯氨酸1.154 mg、酪氨酸0.687 mg、缬氨酸0.707 mg、蛋氨酸0.734 mg、异亮氨酸1.057 mg、亮氨酸0.790 mg、苯丙氨酸0.684 mg、赖氨酸0.724 mg的混合对照品储备液。使用时候将储备液稀释10倍作为氨基酸对照品工作液。

1.2.3 供试品溶液制备

分别取无籽刺梨与刺梨(除籽)果实适量用组织捣碎机捣碎成浆，精密称定0.3g，置聚四氟乙烯水解罐中，精密加入6 mol·L-1盐酸溶液(含0.1%苯酚)10 mL，于恒温烘箱中110 ℃水解24 h，取出冷却，过滤于25 mL容量瓶中，用纯净水洗涤滤渣并定容。将溶液于旋转蒸发仪上65 ℃浓缩，用0.1 mol·L-1盐酸溶解，将溶液转入10 mL容量瓶中，定容。

1.2.4 样品衍生化反应

分别准确移取对照品溶液、供试品溶液各200 μL，置 1.5 mL离心管中，准确加入1.0 mg·L-1正亮氨酸溶液20 μL，再加入0.1 mol·L-1异硫氰酸苯酯乙腈溶液100 μL、1 mol·L-1三乙胺乙腈溶液100 μL，混匀，室温放置1 h，加入正己烷400 μL，快速混匀器振荡混匀后，静置10 min，用注射器吸取下层溶液, 经0.45 μm滤膜过滤后进样进行色谱分析。

1.2.5 进样分析

取衍生化完以后的氨基酸对照品和供试品溶液上机测试，进样2μL，记录谱图峰面积，以正亮氨酸为内标，按照内标法计算样品中各氨基酸的含量。

1.2.6 氨基酸组成和营养分析

根据1973年WHO/FAO提出的蛋白质评价方法[10]，分别计算必需氨基酸与总氨基酸的百分比值(E/T)、必需氨基酸与非必需氨基酸的比值(E/N)，将这两个值与推荐值比较，得出所含氨基酸是否符合理想蛋白质要求。根据WHO/FAO氨基酸标准模式谱，计算Thr、Val、Leu、Ile、Lys、Phe+Tyr、Met+Cys与总氨基酸的百分比含量进行比较，得出是否符合人体蛋白质组成，判断其营养价值。计算味觉氨基酸(鲜味、甜味、芳香族)，药效氨基酸，支链氨基酸等功能氨基酸的含量。

2 结果与分析

2.1 氨基酸标准谱图与样品谱图比对

图1 混合氨基酸对照品(A)、无籽刺梨(B)和野生刺梨样品样品(C)HPLC色谱图

Fig.1 HPLC chromatograms of mixed reference substances(A) , Rosa sterilis sample(B) and wild Rosa roxburghii sample(C)

氨基酸的标准谱图为图1A，样品谱图为图1B和1C，16号峰为正亮氨酸的内标峰。由色谱图出峰时间定性，无籽刺梨与刺梨均无13号胱氨酸的色谱峰，均含有16种氨基酸，色氨酸被酸水解破坏均未测出[11]。按照出峰顺序依次为：天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、丝氨酸(Ser)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、精氨酸(Arg)、苏氨酸(Thr)、丙氨酸(Ala)、脯氨酸(Pro)、酪氨酸(Tyr)、缬氨酸(Val)、蛋氨酸(Met)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、正亮氨酸(Nle)、苯丙氨酸(Phe)、赖氨酸(Lys)。

2.2 氨基酸组成与含量

由氨基酸含量分析可知，无籽刺梨与野生刺梨均含有人体必需氨基酸7种(Thr、Val、Phe、Met、Ile、Leu、Lys)，其中，无籽刺梨的总氨基酸含量最高，为61.70 mg·g-1。两种植物的果期存在差异，无籽刺梨晚于刺梨的成熟期。分析结果显示，无籽刺梨的氨基酸含量高于野生刺梨(表1)。

表1 刺梨与无籽刺梨果实氨基酸组成与含量

注：a人体必需氨基酸；b儿童必需氨基酸；c味觉氨基酸；d药效氨基酸；e支链氨基酸。T总氨基酸；E必需氨基酸；N非必需氨基酸；CE儿童必需氨基酸。

2.3 氨基酸的组成分析

2.3.1 必需氨基酸比例

FAO/WHO在1973年提出的理想蛋白质的标准：E/T在40%左右，E/N在0.60以上[10]。根据表1分析，无籽刺梨的人体必需氨基酸的含量高于野生刺梨的氨基酸，而儿童氨基酸则略低于野生刺梨。无籽刺梨成熟果实中的E/T值为38.03%，E/N/值为61.38%，无籽刺梨中的蛋白质接近理想蛋白质的要求。野生刺梨的E/T值与E/N值分别为36.26%、56.88%，略低于无籽刺梨，但也接近理想蛋白质组成。两种植物的儿童氨基酸含量比较，野生刺梨为10.49%，高于无籽刺梨的7.52%。

2.3.2 人体必需氨基酸比例与模式谱的比较

由表2可知，与氨基酸模式谱比较，无籽刺梨的Met+Cys低于氨基酸模式谱，其他指标基本符合WHO/FAO氨基酸标准。野生刺梨中Met+Cys低于模式谱，而Phe+Tyr接近于模式谱要求。Lys为人体第一限制性氨基酸，缺乏Lys会影响其他体内蛋白的合成，影响大脑发育[12]；总体上两种植物中Lys的量均高于WHO/FAO氨基酸模式谱，但无籽刺梨中的Lys含量略高于野生刺梨。其丰富的赖氨酸含量，也是现在保健食品的依据之一。

表2 人体必需氨基酸的比例与WHO/FAO氨基酸模式谱的比较

Table2 Comparison of essential amino acid composition in samples and WHO/FAO recommended pattern

注：未检出Cys，仅为Met的含量

2.4 药效氨基酸分析

药效氨基酸有Asp、Glu、Gly、Met、Leu、Tyr、Phe、Lys、Arg 9种，这些氨基酸在人体的正常生理活动中发挥着重要的作用。Asp能缓解疲劳；Glu通过合成谷氨酰胺，解除氨毒害，具有健脑益智作用[13]；Arg能增强免疫、促进胰岛素释放从而治疗糖尿病[14]；Gly具有抗炎、护肝、提高运动能力的作用[15]；Met能预防脂肪肝[16]；Leu能促进胃液分泌；Lys是大脑神经细胞再生的第一限制性氨基酸，缺乏影响大脑发育[12]。由表1可知，无籽刺梨与野生刺梨中的药效氨基酸分别为41.3 mg·g-1、32.9mg·g-1，药效氨基酸的含量都在总氨基酸的60%左右。由于特殊功效氨基酸的存在，使两种植物在医疗保健食品方面具有很广阔的开发前景。

2.5 味觉氨基酸分析

氨基酸是维系人体生命活动的重要物质，它不仅具有各种生理功能，还在食品的呈味方面扮演着十分重要的角色[16]。鲜味氨基酸有Asp、Glu，它们含量多少直接影响了食物的鲜美程度；甜味氨基酸有Ala、Gly、Ser、Pro，它们的含量决定着食物的甜美程度；芳香族氨基酸有Phe、Tyr，能增进食物的香味，它们含量的多少决定着食物的香美程度。从表3可知，无籽刺梨与野生刺梨的鲜味氨基酸分别为14.07 mg·g-1、13.92 mg·g-1，两者的鲜味氨基酸的含量很接近。但是甜味类氨基酸和芳香类氨基酸都是无籽刺梨的优于野生刺梨，无籽刺梨的甜味氨基酸为19.05 mg·g-1，芳香类氨基酸为6.16 mg·g-1；野生刺梨的甜味氨基酸为12.29 mg·g-1，芳香氨基酸为2.96 mg·g-1。目前，无籽刺梨与刺梨可加工果脯、果汁、果酱等食品，除了与其丰富的Vc、SOD等营养成分以外[13]，其自身味道也是一个的因素，而它们所含的味觉氨基酸在它们的呈味过程中起到了不可忽视的作用。

表3 味觉氨基酸含量 mg﹒g-1

2.6 支链氨基酸分析

支链氨基酸(BCAA)包括Leu、Ile和Val，研究证实，支链氨基酸能有效改善应激状态下机体糖利用障碍、减少骨骼肌蛋白分解代谢、增加肝和骨骼肌蛋白合成；可减轻病人肝性脑病的程度，减轻肝的负担，维护肝功能；还能提高运动耐力、恢复肌肉疲劳、保护心脏[12，18-19]。BCAA被推荐用于肝性脑病、感染、创伤等应激病人的营养治疗[18-19]。无籽刺梨中支链氨基酸的含量为12.86 mg·g-1，野生刺梨中的支链氨基酸为9.89 mg·g-1(表1)。其丰富的支链氨基酸含量，在作为护肝保健品等的领域值得人们深入开发以及研究。

3 结论与讨论

3.1 通过无籽刺梨与野生刺梨成熟果实的氨基酸对比分析，无籽刺梨各种类型的氨基酸的总量高于野生刺梨。与WHO/FAO氨基酸模式谱比较，无籽刺梨与野生刺梨中Cys+Met不符合模式谱，其它的基本符合氨基酸模式谱要求。总体上比较，无籽刺梨与野生刺梨的氨基酸组成都接近理想蛋白质，与人的蛋白质组成相似，均具有很高的营养价值。氨基酸的种类是否齐全与其含量影响着果品的营养价值与药用价值，所以氨基酸的含量可作为鉴别果实品质优劣的依据之一[20]。目前关于无籽刺梨基地土壤质量的研究较多，涉及到无籽刺梨基地土壤肥力、养分状况和重金属风险评价等方面[21-23]，无籽刺梨氨基酸等营养指标与土壤养分的关系有待进一步研究。

3.2 本研究采用高效液相色谱法测定的味觉氨基酸的组成无籽刺梨与野生刺梨的鲜味氨基酸的含量很接近，有学者采用氨基酸分析仪分析表明，刺梨具有更高的营养价值[6]，这可能与供试材料有关，前者采用的“贵农5号”刺梨是从野生刺梨优良单株无性系选育出的新品种，丰产性和品质均高于野生刺梨[24]，本研究材料取自野生刺梨。因为无籽刺梨其自身的果实特性，综合其营养保健价值和经济效益，无籽刺梨在药食领域有着很好的发展前景。

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DeterminationofAminoAcidsinRosaSterilisandWildRosaRoxburghiibyHPLC

LinTao1,LiJieling1,FuYuanhong1,YangWeiling2

(1. Key Laboratory for Information System of Mountainous Area and Protecion of Environment of Guizhou Province, Guiyang 550001,China；2. College of Food Safety, Guizhou Medcial University, Guiyang 550001, Chnia)

To provide scientific basis for further research and development for Rosa sterilis and Rosa roxburghii in Guizhou, this paper adopt hydrochloric acid hydrolysis method, using norleucine as the internal standard, then derivatized with phenylisothiocyanate (PITC) and determined by HPLC, analysis the amino acids composition and nutritional evaluation at last. Results showed that three samples contained 16 kinds of amino acids. Compared with Rosa roxburghii, total amino acid, essential amino acids, children's essential amino acids, taste amino acids, pharmacodynamics amino acids and branched chain amino acid in the fruit of Rosa sterilis were higher. Analysis of amino acid composition, in addition to Cys+Met, others are in accordance with WHO/FAO amino acid pattern spectrum.

high performance liquid chromatography (HPLC); Rosa sterilis; Rosa roxburghii; amino acids; nutritional evaluation

2017-08-28

州省农业科技攻关项目(黔科合NY[2015]3022-1号)，教育部长江学者和创新团队发展计划(IRT1227)，贵州省林业厅项目(黔林科合[2016]09)，贵州师范大学博士科研基金

林 陶(1964—)，博士，副教授，研究方向：植物生态学。

S667.9

A

1008-021X(2017)18-0076-04

(本文文献格式林陶，李婕羚，付远洪.无籽刺梨与野生刺梨果实的氨基酸含量及组成[J].山东化工，2017，46(18)：76-79.)