基于党参有效成分的凝血酶抑制剂的分子模拟

杨 春,陈盼盼, 张静晓, 张丽雷

(湖北民族学院 化学与环境工程学院，湖北 恩施 445000)

基于党参有效成分的凝血酶抑制剂的分子模拟

杨 春,陈盼盼, 张静晓, 张丽雷*

(湖北民族学院 化学与环境工程学院，湖北 恩施 445000)

以中药党参有效成分为研究对象，使用ADME特性筛选，分子对接和分子动力学方法，研究了与凝血酶的抑制作用。结果表明，筛选出的灌木远志酮A和川芎哚具有较好的对接结果。通过分子动力学方法分别获取了灌木远志酮A和川芎哚与凝血酶结合的稳定结构。两种化合物分别与凝血酶的残基形成了疏水作用和强度不同的氢键，这些基团之间的相互作用是化合物可能具有相应活性的关键因素。川芎哚的抑制能力强于灌木远志酮A，形成氢键的数目及氢键存活率是其稳定性的主要原因。结果可为发现高效的直接凝血酶抑制剂，以及结构改良提供理论参考。

党参；凝血酶；ADME筛选；分子对接；分子动力学

血液凝固是生理性止血功能的重要组成部分[1]。对人体健康具有重要意义，然而在病态下引起的凝血会形成血栓，造成心肌缺血、心肌梗塞和脑血栓等疾病[2]。凝血酶与血小板表面的凝血酶受体N端结合并将其水解切断，产生出新N端，新N端通过分子内反应与凝血酶受体自身结合，从而激活凝血酶受体，引发细胞内信号的传递，最终导致血小板聚集，产生凝血[3]。中药党参具有调节血糖，促进造血机能，降压，抗缺氧，耐疲劳，增强机体免疫力，延缓衰老，调节胃收缩及抗溃疡等多种作用[4-5]。本文以党参为研究对象，从中筛选有效成分，研究其与凝血酶靶点的相互作用，为直接凝血酶抑制剂的研究和党参的药用机理提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 党参有效成分的筛选

在中药数据库TCMSP中获取党参的有效化学成分，根据类药性(DL)、口服可利用度(OB)和Caco-2渗透性，设定阈值进行筛选。同时，利用HIT数据库和SEA数据库对其对应靶点进行预测，获取与凝血酶靶点相关的活性成分，作为凝血酶的配体。

1.2 初始结构的准备

从蛋白晶体数据库(PDB)中得到含有UBTHR104的凝血酶晶体结构(PDB号：3SI4)，除去UBTHR104和晶体水，对其进行加氢，作为分子模拟的凝血酶模型。配体分子从化学结构数据库(http://www.chemspider.com/)中获取。

1.3 分子对接

配体分子与凝血酶的对接采用AutoDock Vina程序进行，使用半柔性对接方法，凝血酶被视为一个刚体和配体分子所有的可旋转键进行对接。最有可能的结合位点采用搜索全局优化法(Iterated Local Search Globule Optimizer)搜索。最佳的结合位点设定为涵盖凝血酶整个活性口袋大小为30×30×40Å3的盒子内，盒子的网格间距为1.0Å，以药物分子的几何中心为中心。

1.4 分子动力学模拟

分子动力学模拟在NAMD(版本2.11)程序中进行，将分子对接得到的复合物结构用做MD模拟的初始构象，采用CHARMM 27全原子力场。在复合物的周围建立超出蛋白分子8 Å的立方体水模型。在进行分子动力学模拟之前，先使整个体系松弛。优化结束后，采取缓慢升温的方法，体系温度在220ps内由0K缓慢加热至310K，之后进行10ns的NPT模拟，使用PME(particle mesh Ewald)方法用来计算长程静电相互作用，范德华相互作用的截断值为12Å。

2 结果与讨论

2.1 筛选结果

以化合物的类药性(DL)、口服可利用度(OB)、Caco-2渗透性参数进行党参有效成分的筛选。其中，DL阈值设定为DL≥0.18。代表化合物具有一定的成药潜力；OB阈值设定为OB≥30%，代表化合物具有一定的在胃肠道的吸收能力、小肠和肝脏的初级代谢能力；Caco-2渗透性设定阈值为Caco-2≥-0.4，代表化合物具有一定的肠道吸收能力。通过筛选，从党参的134个化学成分中筛选出了19个潜在的活性成分。利用数据库，从党参的19种活性成分中，筛选出四种与凝血酶相关的活性成分：川芎哚、异黄酮、灌木远志酮A和3-羟基亚甲基丹参醌。

2.2 对接结果

以筛选所得到的与凝血酶相关的化合物为研究对象，分别与凝血酶进行对接，并通过Autodock vina程序的函数进行对接结果打分。川芎哚、异黄酮、灌木远志酮A和3-羟基亚甲基丹参醌四种物质的打分分别为-8.1、-7.1、-8.5和-7.9，灌木远志酮A 和川芎哚打分相对较高，结合能量较高，表明它们可能与凝血酶具有较好的结合能力。对接位置如图1所示，均对接于凝血酶的活性口袋内。

图1 灌木远志酮A(A)和川芎哚(B)与凝血酶的对接位置

2.3 分子动力学

将灌木远志酮A和川芎哚与凝血酶对接的结果用作初始构象，进行10ns的分子动力学模拟。为了检测MD轨迹的稳定性，对其均方根偏差(root mean square deviation, RMSD)进行了计算，结果如图2所示。从图中可见，这两个体系的骨架原子在经过约5000ps的运动之后，RMSD值趋于稳定，最后灌木远志酮A与凝血酶结合的构象，稳定在0.7Å在左右，川芎哚与凝血酶结合的构象，稳定在0.5Å左右，体系达到平衡结构。

图3 灌木远志酮A(A)和川芎哚(B)与凝血酶的相互作用网络

从5000ps的运动轨迹中，取出最低能量结构进行了相互作用分析。使用软件Ligplot+[6]计算得到灌木远志酮A和川芎哚分别与凝血酶模型的相互作用网络，结果如图3所示。从图中可见，灌木远志酮A和川芎哚均与凝血酶形成疏水相互作用。其中，灌木远志酮A与凝血酶的Leu99、Trp96、Try94、Ala56等四个氨基酸残基有疏水作用，川芎哚与凝血酶的Cys42、Hsd57、Cys58、Glu192、Gly219等5个氨基酸残基有疏水作用，与凝血酶的氨基酸残基Ser195形成了1个氢键。由于蛋白质和药物分子之间形成的氢键有利于它们的结合，说明川芎哚与凝血酶的结合能力强于灌木远志酮A与凝血酶的结合能力。对其氢键进行了分析，结果发现氢键的存活率为32.53%。

分别对灌木远志酮A和川芎哚与凝血酶的相互作用力进行了分析，灌木远志酮A与凝血酶之间的范德华力平均值为-15.94kcal/mol，静电力平均值为-3.56kcal/mol，主要作用力为范德华力，川芎哚与凝血酶之间的范德华力的平均值为 -25.38kcal/mol，静电力的平均值为-21.87kcal/mol，主要作用力为范德华力。

由于灌木远志酮A和川芎哚的抗凝血是通过抗血小板凝聚，而达到抗凝血酶作用。抗抗凝血作用过强，则可能导致出血并发症的发生[7]。在整个MD过程中，灌木远志酮A和川芎哚与凝血酶形成的氢键较少，且较为不稳定，说明其抗凝血过程中，既能达到抗凝血作用，又不至于因为抗凝血作用过强，而导致大出血及出血并发症的发生，是潜在的有效直接凝血酶抑制剂。

3 结论

以中药党参的化学成分为研究对象，通过ADME性质预测和筛选，获得四种与凝血酶相关的有效成分，并通过分子对接发现灌木远志酮A和川芎哚与凝血酶具有较好的对接结果，并对其对接后的复合物进行了动力学模拟，得到了灌木远志酮A、川芎哚与凝血酶的稳定结构，和与凝血酶作用的关键氨基酸。范德华作用力是它们之间的主要作用力。通过对MD过程的分析发现川芎哚与凝血酶的结合更稳定，这可能是由于川芎哚不但与凝血酶的氨基酸残基有疏水作用，并且与残基Ser195形成了1个氢键。这些基团中的相互作用是这两个配体作为潜在的凝血酶抑制剂的主要因素。结果不仅可为中草药党参的作用机理的研究提供参考，并且可为凝血酶靶点抑制剂的设计和结构改良提供理论参考，从而研发出有效的凝血酶抑制剂。

[1] 王鸿利.止血与凝血机制研究进展[J].继续医学教育,2006,20(26):13-19.

[2] Andrews R K, Gardiner E E, Shen Y, et al. Platelet Interactions in Thrombosis [J]. International Union of Biochemistry & Molecular Biology Life, 2004, 56(1): 13-8

[3] 孙政华，邵 晶，郭 玫.党参化学成分及药理作用研究进展[J].安徽农业科学.2015,43(33):174-176

[4] Trott O, Olson A J. AutoDock Vina: Improving the speed and accuracy of docking with a new scoring function, efficient optimization, and multithreading [J]. Journal of Computational Chemistry, 2010, 31(2): 455-461.

[5] Liu H, Wang J, Zhou W, et al.an example using licorice[J]. Journal of Ethnopharmacology,2013,146(3):773-793.

[6] Laskowski R A, Swindells M B. LigPlot+: Multiple Ligand-Protein Interaction Diagrams for Drug Discovery [J]. Journal of Chemical Information & Modeling,2011,51(10):2778-2786.

[7] 郑必龙，刘 俊.华法林抗凝血作用及影响因素分析[J].安徽医学,2013,17(11):1975-1977.

ThrombinInhibitorsMolecularModelingBasedonCodonopsisIngredients

YangChun，ChenPanpan,ZhangLilei*

(Science and Technology College of Hubei University for Nationalities, Enshi 445000, China)

The interaction between the active components of codonopsis and thrombin was studied by ADME screening, molecular docking and molecular dynamics. The results showed that the selected Frutinone A and Perlolyrine have better docking results. By molecular dynamics method, the stable structure of the combination of Frutinone A and Perlolyrine with thrombin were obtained. Two compounds with thrombin formed hydrophobic interactions and different strength hydrogen bonding respectively. The interaction between these groups is the key factor that compounds may have corresponding activity. The result shows that the strength of Perlolyrine is higher than that of Frutinone A. The results can provide theoretical reference for the discovery of efficient thrombin inhibitors and structural improvement.

codonopsis pilosula; thrombin; ADME screening; molecular docking; molecular dynamics

2017-07-07

湖北省教育厅科学技术研究计划项目 (B2016095)

张丽雷(1985—)，讲师，博士。

R973.3

A

1008-021X(2017)18-00007-02

(本文文献格式杨春,陈盼盼,张静晓,等.基于党参有效成分的凝血酶抑制剂的分子模拟[J].山东化工，2017，46(18)：7-8.)