右美托咪定通过调控HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路抗脓毒症大鼠肺损伤的实验研究

张建峰 刘涛 曹波 李明强 吴树宁 周立文 叶习红

右美托咪定通过调控HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路抗脓毒症大鼠肺损伤的实验研究

张建峰 刘涛 曹波 李明强 吴树宁 周立文 叶习红

目的探讨右美托咪定对脓毒症致肺损伤大鼠HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路的调控作用。方法选取30只Wistar大鼠随机分为对照组(假手术)、模型组(盲肠结扎穿孔)、右美托咪定组(盲肠结扎穿孔+右美托咪定处理)，每组10只。右美托咪定组于术前30min腹腔注射40μg/kg 右美托咪定，对照组和模型组腹腔注射生理盐水。造模后24h处死大鼠。苏木精-伊红染色法评估肺组织病理学变化；ELISA法检测肺组织髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)活性；计算肺组织湿干重比(W/D)；western blot法检测肺组织中HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白表达。结果与对照组相比较，模型组大鼠肺组织MPO、肺损伤评分及肺组织W/D显著增高(P<0.05)；与模型组相比较，右美托咪定组大鼠肺组织MPO、肺损伤评分及肺组织W/D显著降低(P<0.05)，但仍高于对照组(P<0.05)。与对照组相比较，模型组大鼠肺组织HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白表达水平显著增高(P<0.05)；与模型组相比较，右美托咪定组大鼠肺组织HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白表达水平显著降低(P<0.05)，但仍高于对照组(P<0.05)。结论右美托咪定可能通过抑制HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路，减轻炎症反应，从而发挥对脓毒症肺损伤的保护作用。

右美托咪定；脓毒症；肺损伤；HMGB1；TLR4

脓毒症是指由感染诱发的全身炎症反应综合征，常伴有多脏器功能障碍[1]。在脓毒症并发的多器官损伤中，肺损伤出现最早，也最为常见，是导致脓毒症患者预后不良的主要因素[2]。右美托咪定属于高效α2肾上腺素能受体激动剂。既往研究证实，右美托咪定可通过抑制机体炎症级联反应，发挥对脓毒症肺损伤的保护作用，但其分子机制尚未明确[3]。肺损伤的发生发展与高迁移率族蛋白B1(high-modility groupbox 1, HMGB1)活化密切相关，后者可通过激活下游Toll样受体4(Toll like receptor 4, TLR4)/核因子κB(nuclear factor kappaB, NF-κB)信号通路致炎症介质过度释放，进而导致组织损伤[4]。右美托咪定是否通过HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路抑制脓毒症所致的炎症级联反应，进而抗脓毒症肺损伤尚未可知。本研究拟采用盲肠结扎穿孔法诱导的脓毒症大鼠为模型，探讨右美托咪定对脓毒症肺损伤的保护作用，并分析右美托咪定对HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路的调控作用，揭示右美托咪定抗脓毒症肺损伤的分子机制，以期为脓毒症肺损伤的临床防治提供新思路。

资料与方法

一、实验动物及试剂

SPF级Wistar大鼠，雄性，15周龄，200-250g，共30只，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。ECL化学发光试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒购于南京建成生物有限公司；HMGB1、TLR4、NF-κB抗体购于大连Santa cruz公司；髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)，酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)试剂盒购于武汉博士德生物有限公司。

二、模型建立与分组处理

所有大鼠应性喂养一周后，随机分为对照组、模型组及右美托咪定组，每组10例。模型组及右美托咪定组大鼠采用盲肠结扎穿孔法建立脓毒症模型：术前禁食12h，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，沿腹正中线做1cm长切口，游离盲肠及肠系膜，用4-0丝线对盲肠进行环形结扎，在盲肠结扎端用18号针头进行贯通穿刺，之后还纳肠段，常规缝合腹膜、皮肤。对照组仅常规开腹。右美托咪定组于术前30min给予腹腔注射40μg/kg 右美托咪定，模型组和对照组于相同时间点注射等量生理盐水。

三、标本取材

造模后24h处死大鼠，之后沿胸骨正中线剪开胸骨，暴露肺脏，结扎并剪取右侧肺脏，-80℃冰箱保存备用。

四、肺组织病理学观察

4%多聚甲醛固定肺组织24h，然后常规行组织石蜡包埋、切片及苏木精-伊红染色。光镜下依据肺泡内细胞浸润、肺泡出血、肺泡间隔水肿及肺泡内纤维蛋白沉积4个方面情况进行肺损伤病理学评价，每只大鼠取4张切片，每张切片观察6个不同视野，分别记录病理学评分，最后取平均值。

五、髓过氧化物酶(MPO)活性

准确称取肺组织，用0℃生理盐水制备5%肺组织匀浆，肺组织匀浆37℃水浴15min，按ELISA试剂盒说明书进行实验操作，测量样本490nm处OD值，根据OD值换算MPO活性。

六、肺组织湿干重比(W/D)测定

取出大鼠右肺后，立即用滤纸拭干肺组织表面水分、血液，用天平所称得其质量为湿重，之后将肺组织放入80℃烤箱烘烤48 h，再次用天平所称得其质量为干重，计算湿干重比(W/D)。

七、HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白测定

采用western blot法检测肺组织中HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白表达。将肺组织、裂解液混合物置于匀浆器中，充分研磨后得到组织匀浆，冰上裂解30min后，离心10min，收集上清，BCA蛋白定量试剂盒检测样品蛋白浓度，常规电泳、转膜、孵育，加入一抗(HMGB1、TLR4、NF-κB、β-actin)(1:2000)，4℃孵育过夜，TBS缓冲液洗涤3次，加入相应二抗(1:500)，室温孵育2h，常规显影，并进行定量分析。

八、统计学分析

结 果

一、肺组织损伤程度

对照组大鼠肺组织结构完整，无炎性细胞渗出；模型组大鼠肺组织结构破坏，肺泡腔内可见大量炎性细胞渗出，肺间质弥漫性出血；右美托咪定组大鼠肺组织炎症细胞渗出及出血程度较模型组明显减轻(见图1)。

图1 三组大鼠肺组织病理切片(苏木精-伊红染色，×100)

二、肺损伤指标

与对照组相比较，模型组大鼠肺组织MPO、肺损伤评分及肺组织W/D显著增高(P<0.05)；与模型组相比较，右美托咪定组大鼠肺组织MPO、肺损伤评分及肺组织W/D显著降低(P<0.05)，但仍高于对照组，P<0.05，(见表1)。

表1 三组大鼠各项肺损伤指标比较

注：与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05

三、肺组织HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白表达

与对照组相比较，模型组大鼠肺组织HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白表达水平显著增高(P<0.05)；与模型组相比较，右美托咪定组大鼠肺组织HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白表达水平显著降低(P<0.05)，但仍高于对照组，P<0.05，(见表2、图2)。

图2 三组大鼠肺组织HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白表达

表2 三组大鼠肺组织HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白相对表达量比较

注：与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05

讨 论

脓毒症常并发多器官功能障碍综合征(Mutiple organ disfunction syndrome, MODS)，而肺脏则往往是受累的首位靶器官[5]。在脓毒症病程早期就可出现急性肺损伤，之后随着病情进展，肺纤维化程度日益加重，最终导致呼吸衰竭、死亡[6-7]。据统计，脓毒症危重患者肺损伤发生率为70%，死亡率为40%，已成为致脓毒症患者死亡的首位原因[8]。因此，防治脓毒症肺损伤是改善临床预后的关键。

脓毒症所致肺损伤与HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路激活密切相关。正常生理状态下， HMGB1存在于核内，稳定核染色体和调控蛋白转录、翻译[9]；但脓毒症时，在早期炎症介质和内毒素的刺激下，单核/巨噬细胞通过出胞作用将HMGB1大量释放到胞外，之后HMGB1与其内源性配体TLR4在胞外结合，激活MyD88依赖性途径，使NF-κB结构中的IκB磷酸化，实现NF-κB活化，实现HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路激活，从而诱导白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)等炎症介质大量分泌，导致毛细血管内皮细胞和肺泡上皮细胞损伤，造成肺组织结构和功能破坏[4]。此外，IL-6、TNF-α等促炎因子又可反过来促进HMGB1分泌，正反馈瀑布式扩大炎症级联反应，进一步加剧肺组织损伤[10]。本研究结果显示，盲肠结扎术后模型组大鼠肺组织MPO、肺损伤评分及肺组织W/D显著增高(P<0.05)，提示盲肠结扎诱发了大鼠肺组织炎性反应，导致急性肺损伤；以此同时，模型组肺组织HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白表达显著增高(P<0.05)，HMGB1、TLR4及NF-κB表达与肺组织损伤程度存在某种正相关性，提示HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路激活在脓毒症肺损伤中发挥重要作用。

右美托咪定属于新型α2肾上腺素能受体(α2-AR)激动剂，其可通过与α1及α2肾上腺素能受体选择性结合，发挥抑制交感神经及刺激迷走神经的双重作用，并兼具镇静、镇痛及抗炎等功效[11]。动物研究证实，右美托咪定具有多器官保护作用，而其抗脓毒症肺损伤作用，可能与抑制HMGB1、IL-6等炎症介质分泌有关，但其分子机制尚未完全明确[3，12-13]。本研究结果显示，采用右美托咪定进行预处理，脓毒症大鼠肺组织HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白表达显著减少，同时肺组织结构和功能得到明显改善，提示右美托咪定可能是通过激活HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路抗脓毒症肺损伤。

综上所述，右美托咪定可抑制脓毒症所致的HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路激活，减轻炎症反应，从而发挥对脓毒症肺损伤的保护作用。但右美托咪定是否还可通过调控其他信号通路影响脓毒症致肺损伤，仍有待进一步研究证实。

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Studyofdexmedetomidineagainstratsepsis-inducedlunginjurybyregulatingHMGB1/TLR4/NF-κBsignalingpath

ZHANGJian-feng,LIUTao,CAOBo,LIMing-qiang,WUShu-ning,ZHOULi-wen,YEXi-hong

XiangyangCentralHospital,Xiangyang,Hubei441021,China

ObjectiveTo evaluate the effect of dexmedetomidine against rat sepsis-induced lung injury by regulating HMGB1/TLR4/NF-κB signaling pathway.Methods30 Wistar rats were randomly divided into the control group (sham-operation), the model group (cecal ligation and puncture) and the dexmedetomidine group (cecal ligation and puncture+dexmedetomidine treatment), 10 rats in each group. 30min before operation, the dexmedetomidine group was intraperitoneal?injected with 40μg/kg dexmedetomidine, and the control group and model group were intraperitoneal?injected with normal saline. 24 hours after modeling, pulmonary pathological changes were detected by hematoxylin-eosin staining. The myeloperoxidase (MPO) activity of lung tissue were detected by ELISA method. The wet and dry weight ratio (W/D) of lung tissue was detected. The protein expression of HMGB1, TLR4 and NF-κB in lung tissue were detected by Western blot.ResultsCompared with the control group, the MPO, lung injury score and lung tissue W/D increased significantly in the model group (P<0.05). Compared with the model group, the MPO, lung injury score and lung tissue W/D decreased obviously in the dexmedetomidine group (P<0.05), but they were still higher than those in the control group. Compared with the control group, the MPO, protein expression of HMGB1, TLR4 and NF-κB increased significantly in the model group (P<0.05). Compared with the model group, the protein expression of HMGB1, TLR4 and NF-κB of the dexmedetomidine group significantly decreased (P<0.05), but still higher than those in the control group.ConclusionDexmedetomidine can inhibit HMGB1/TLR4/NF-κB signaling pathways, reduce inflammation, playing a role of protection for sepsis-induce lung injury.

dexmedetomidine; sepsis; lung injury; HMGB1; TLR4

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.010.005

湖北省自然科学基金面上项目(No 2014CFC1076)

441021 湖北 襄阳，襄阳市中心医院麻醉科，湖北文理学院附属医院麻醉科

刘涛，E-mail:liutao558558@163.com

2017-02-28]