邢台地区275株结核分枝杆菌VNTR基因分型及表型耐药研究

张志 李雅楠 高会霞 许怡 戴二黑

邢台地区275株结核分枝杆菌VNTR基因分型及表型耐药研究

张志 李雅楠 高会霞 许怡 戴二黑

目的初步了解邢台地区结核分枝杆菌临床分离株的基因型多态性及表型耐药特征，探讨各基因型与表型耐药之间的相关性。方法收集2014年1月至2014年10月期间在邢台市传染病医院就诊的结核病患者经临床分离培养得到的结核分枝杆菌菌株及相应病例背景资料，采用15位点数目可变串联重复序列分析(VNTR)进行基因分型研究，采用比例法进行一线抗结核药的药物敏感性试验。运用BioNumerics 5.0软件进行聚类分析，运用SPSS16.0软件进行数据分析。结果该地区的总耐药率为31.6%，初始耐药率为24.2%，获得性耐药率为56.3%。复治患者的耐药率显著高于初治患者耐药率。275株结核分枝杆菌可分为145种VNTR基因型，其中165株菌被聚类为35个簇，110株菌的基因型为独特基因型。VNTR对所有菌株的HGDI值为0.9838。成簇型菌株与独特型菌株在患者年龄、性别、职业、地势、治疗史、吸烟史、糖尿病史等的分布差异无统计学意义。成簇型菌株与独特型菌株的单耐药水平和耐多药水平也无统计学差异。结论邢台地区的结核分枝杆菌临床分离株呈现明显的基因多态性。本研究尚未发现VNTR基因分型与表型耐药的相关性。

结核分枝杆菌；基因分型；多位点数目可变串联重复序列

结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)感染引起的呼吸道传染性疾病。随着京津冀一体化加速，人口流动性增加，艾滋病广泛传播，结核病疫情不断加剧。分子流行病学研究能够从病原分子水平监测传染病的暴发、追踪传染源并揭示感染传播机制。但是，目前尚无邢台地区结核分枝杆菌分子流行病学研究的报道。本研究拟通过数目可变串联重复序列分析(VNTR)对邢台地区MTB临床分离株进行基因分型研究，以初步了解该地区MTB的基因分型特征，并采用比例法进行一线抗结核药物敏感试验，探讨各基因型与表型耐药之间的相关性。

资料与方法

一、菌株来源

在2014年1月至2014年10月共收集到结核分枝杆菌临床分离株275株。所有菌株均在邢台市传染病医院就诊的结核病患者的痰标本，经临床分离培养获得，并经PNB/TCH鉴别培养基鉴定的结核分枝杆菌临床分离株，-80℃保存。结核分枝杆菌标准株H37Rv由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所结核病室提供。

二、病例信息

男性患者181例，女性患者94例。初治211例，复治64例。93名患者有吸烟史，36名患者合并糖尿病。患者以农民、学生、工人为主，其中农民有151例，占总数的54.9%。

三、主要试剂

异烟肼、利福平、乙胺丁醇和链霉素含药培养基，购自武汉贝索生物技术有限公司。DNA提取试剂盒购自美国Qiagen公司，2×Taq MasterMix购自北京康为世纪生物科技有限公司。PCR引物由北京天一辉远生物公司合成。

四、药敏试验

采用比例法药敏试验，按照《结核分枝杆菌药物敏感性实验标准化操作程序及质量保证手册》的固体培养标准化操作步骤进行[1]。取适量菌悬液采用浓度梯度稀释法制备浓度分别为10-2mg/mL和10-4mg/mL的菌悬液，分别接种于4种含药培养基(异烟肼、利福平、链霉素和乙胺丁醇)和阴性对照培养基斜面上，每批实验以H37Rv标准菌株作为阳性对照。接种后的培养基放于37℃培养，每周观察一次，28后记录结果。耐药百分比=(含药培养基的菌落数/阴性对照培养基的菌落数)×100%。若耐药百分比>1%，认为该菌对该抗结核药耐药；若耐药百分比≤1%，认为是敏感菌。

五、DNA提取

将菌落从罗氏培养基上刮下，置于200μL 细菌裂解液中，置于涡流机充分震荡。金属浴100℃，10min后拿出，置于室温2min。13,000g离心5min。取上清液移至1.5mL离心管中。-20℃保存备用。

六、VNTR检测

1 采用15位点VNTR对菌株进行基因分型研究[2-3]。采用Hunter-Gaston分辨指数(Hunter- Gaston discriminatory Index，HGDI)来评价各位点对菌株的分辨能力，即等位基因多态性。采用成簇率评价该地区菌株的近期传播情况。计算公式：

(其中N代表菌株总数，s代表总的基因型数，nj代表属于j基因型的菌株数)

2 PCR反应体系(20μL)：上、下游引物(10μM)各1μL，DNA模板1μL，2×Taq Master Mix 10μL，ddH2O 7μL；阳性对照为结核分枝杆菌H37Rv，阴性对照为ddH2O。

3 PCR反应条件：94℃ 5min(预变性)，94℃ 30s(变性)，60℃ 30s(退火)，72℃ 45s(延伸)，35个循环；72℃ 10min(充分延伸)。

4 检测和分析：配置浓度为1.5%的琼脂糖凝胶(其中加入0.4μg/mL的DNA染料GoldView),上样量为3 μL，电泳电压采用10 V/cm，当指示剂距下一排上样孔2cm时，停止电泳。采用BIO-RAD凝胶成像仪进行凝胶成像，以标准菌株H37Rv作为对照，用100 bp DNA Marker来确定相对分子质量的大小，将指纹图谱数字化，再用BioNumerics 5.0软件(Applied Maths，比利时)进行聚类分析。

七、统计分析

计数资料之间的比较采用χ2检验或Fisher确切概率检验。所有假设检验均为双侧检验，P值小于0.05时，认为差异有统计学意义。

结 果

一、药敏结果

188株MTB菌株对四种一线抗结核药(异烟肼、利福平、链霉素和乙胺丁醇)均敏感，87株至少对一种药物耐药。其中，17株单耐链霉素，6株单耐异烟肼，3株单耐利福平，1株单耐乙胺丁醇，3株对链霉素和异烟肼同时耐药，5株对异烟肼和利福平同时耐药，3株对链霉素和利福平同时耐药，1株对链霉素和乙胺丁醇同时耐药，20株对链霉素、异烟肼和利福平同时耐药，5株对异烟肼、利福平和乙胺丁醇同时耐药，23株对四种药均耐药。耐两种以上药物的菌株有60株，占所有菌株的21.8%，占耐药株的69.0%。复治患者的耐药率为56.3%(36/64)，初治患者的耐药率为24.2%(51/211)，复治患者的耐药率显著高于初治患者的耐药率，差异有统计学意义(P<0.0001)。此外，分析了敏感菌株和耐药菌株与患者背景资料之间的相关性，结果显示，敏感菌株和耐药菌株在患者年龄、性别、职业、生活地势、吸烟史、糖尿病史以及治疗史等方面的分布无统计学差异，(见表1)。

二、数目可变串联重复序列分析

本研究选取了15个VNTR基因位点对275株结核分枝杆菌临床分离株进行基因分型，结果显示不同菌株的DNA指纹图谱在某些位点呈现多态性，在某些位点呈现一致性，聚类分析结果(见图1)。经BioNumerics软件聚类分析，275株结核分枝杆菌呈现145种基因型，其中110株菌为单一菌株类型，呈现独特的基因型，占所有菌株的40.0%；165株菌可被聚类为35个簇，占所有菌株的60.0%。最大的一簇包含28株(10.18%)菌株，在15个VNTR位点的扩增片段拷贝数依次为：4 2 4 3 5 3 3 5 7 3 3 3 5 4 4。成簇型和独特型在患者的年龄、职业、地势、性别、吸烟史、糖尿病及结核病治疗史等之间的差异无统计学意义(P值均>0.05)。(见表2)。

三、成簇型和独特型结核分枝杆菌与表型耐药的相关性分析

本研究将275株结核分枝杆菌分为成簇型和独特型，分别为165株(60.0%，165/275)和110株(40.0%，110/275)。其中任意耐药成簇型菌株为46株(27.9%，46/165)，任意耐药独特型菌株为31株(28.2%，31/110)。经卡方检验，成簇型菌株和独特型菌株的任意耐药率无统计学差异，各药的单耐药率由于菌株数量太少，无法统计(见表3)。

图1 VNTR聚类分析树状图

特征分类所有菌株(n=275)耐药菌株(n=87)OR值(95%CI)χ2值P值年龄 <2025(9．1%)10(40．0%)1．0 20-129(46．9%)42(32．6%)0．7241(0．300-1．748)0．51860．4715 40-81(29．5%)26(32．1%)0．7091(0．281-1．791)0．53180．4659 ≥6040(14．5%)9(22．5%)0．4355(0．146-1．297)2．2780．1313职业 工人31(11．3%)8(25．8%)1．0 农民151(54．9%)39(25．8%)1．001(0．414-2．422)0．0000．9980 学生37(13．5%)14(37．8%)1．750(0．616-4．969)1．1160．2909 其他56(20．4%)26(46．4%)2．429(0．953-6．514)3．5640．0590地势 山区65(23．6%)23(35．4%)1．00．55290．4571 平原210(76．4%)64(30．5%)0．801(0．445-1．440)性别 女性94(34．2%)28(29．8%)1．00．22580．6347 男性181(65．8%)59(32．6%)1．140(0．664-1．957)吸烟史 无182(66．2%)56(30．8%)1．00．18710．6653 有93(33．8%)31(33．3%)1．125(0．660-1．919)糖尿病 无239(86．9%)75(31．4%)1．00．05520．8143 有36(13．1%)12(33．3%)1．093(0．519-2．303)治疗史 初治211(76．7%)51(24．2%)1．023．37<0．0001 复治64(23．3%)36(56．3%)4．034(2．245-7．248)

OR: Odds ratio,相对危险度，以耐药菌株计算。CI：Confidence interval,可信区间。

四、VNTR多态性检测

本次共选取了15个特异性较好的VNTR位点来进行检测分析，结果显示邢台地区结核分枝杆菌的不同位点的多态性，即汉高指数(Hunter-Gaston discriminatory index, HGDI)具有较大差异，HGDI值越大表示该位点的多态性越好。一般来说，HGDI>0.60表示分辨能力较高，多态性较好；0.3

讨 论

本研究对275株分离自邢台地区结核病患者痰标本的结核分枝杆菌菌株进行了基因分型和表型耐药检测，结果显示该地区结核分枝杆菌菌株的总耐药率为31.6%(87/275)，略低于2010年全国第五次结核病流行病学抽样调查结果(36.8%)[4]。耐两种及两种以上抗结核药物的菌株有60株，占所有菌株的21.8%(60/275)，主要集中在复治患者中，由此分析，长期不规律应用抗生素是造成菌株耐药的一个重要因素。因此临床上应规范使用抗结核药物，根据药敏结果及时调整治疗方案，同时应提高病人用药的依从性，从源头上降低耐药性的产生。

表2 VNTR结果与患者临床资料之间的相关性

OR: Odds ratio,相对危险度。CI：Confidence interval,可信区间。

表3 成簇型和独特型与表型耐药的相关性分析

注：表中括号外数值为各类耐药的菌株数，括号内数值为“耐药率(%)”；“-”表示菌株数量太少无法进行统计。

表4 各VNTR位点的等位基因多态性

本研究发现，邢台地区结核病患者的男女比例为1.93:1(181:94)，各年龄段均有发病，20-30岁患病人数最多，占总数的46.9%，其次是40-50岁，占29.5%。男性患者的菌株耐药率和VNTR成簇率均高于女性患者的菌株耐药率和VNTR成簇率，但差异并无统计学意义。刘泓等[5]分析了肺结核患者产生耐药的危险因素，结果发现耐药性的产生与性别、年龄、职业、吸烟史等无关，与治疗史有关，复治患者产生耐药的危险性是初治患者的3.324倍，与本文的分析结果一致。

本文通过VNTR基因分型研究发现，邢台地区结核分枝杆菌呈现明显的基因型多态性。HGDI值显示，本研究所采用的15位点VNTR分型技术适合用于邢台地区结核分枝杆菌的基因分型研究。275株结核分枝杆菌通过VNTR可分为成簇型和独特型，成簇率为60.0%(165/275)。有文献报道[6]样本的成簇率是评价基因分型技术功效的重要指标。本研究所得数值略低于金标法IS6110-RFLP(79%)的结果，而高于Spoligotyping分型的成簇率55%[7]。成簇的例数高达60%以上，提示结核病主要是由于近期感染所致[8]，本研究显示，邢台地区结核病疫情近期感染较为严重。根据山东[9]、四川[10]报道成簇型菌株的耐药率显著高于独特型菌株的耐药率，而本研究发现邢台地区成簇型和独特型菌株在单耐药水平和耐多药水平上无统计学差异，提示近期传播致病在全敏感菌株和耐药菌株的发生机制中的作用相当。由于本文所收集的菌株数量不够大，且时间相对集中，因此不能全面准确反映邢台地区结核分枝杆菌的基因型分布状况以及基因型的临床意义，需要今后收集更多菌株进行深入研究。

近年来，由于结核分枝杆菌耐药株的广泛传播使得全球结核病再度肆虐，主要原因之一就是结核分枝杆菌的变异。因此从分子水平研究结核分枝杆菌的基因特征并进行分型鉴定，明确主要流行菌型，对结核病的有效防治有重要意义。

[1] 赵雁林，王黎霞，成诗明，等.结核分枝杆菌药物敏感性实验标准化操作程序及质量保证手册[M].北京：人民卫生出版社，2013：1-40.

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[3] 曹晓慧，蒋毅，张媛媛.13个VNTR位点用于113株结核分枝杆菌的基因分型研究[J].中华流行病学杂志，2006，27(8)：705-708.

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StudyonVNTRgenotypesanddrugresistancephenotypesof275mycobacteriumtuberculosisclinicalisolatesfromXingtaiarea

ZHANG Zhi, LI Ya-nan, GAO Hui-xia, XUYi, DAI Er-hei

the Fifth Hospital of Shijiazhuang, Shijiazhuang, Hebei 050021, China

ObjectiveTo understand the characteristics of genotypes and drug resistance phenotypes of mycobacterium tuberculosis clinical isolates from Xingtai and to explore the association of genotypes and drug resistance phenotypes.MethodsThe mycobacterium tuberculosis clinical strains isolated from TB patients in the Fifth Hospital of Xingtai and the corresponding clinical information of the patients were collected from January 2014 to October 2014. The 15-locus variable number tandem repeats (VNTR) was used to genotype the strains, and the first-line anti-TB drug susceptibility testing was performed using the proportion method. Clustering analysis was done by BioNumerics 5.0 software and statistical analysis was done by SPSS 16.0 software.ResultsThe total drug resistance rate of MTB in this district was 31.6%, the initial drug resistance rate was 24.2%, and the acquired drug resistance rate was 56.3%. The drug resistance level of re-treatment was significantly higher than that of new cases. The 275 MTB strains were divided into 145 VNTR genotypes, of which 165 strains were clustered into 35 groups and 110 strains were individual types. The HGDI value of VNTR was 0.9838. There was no significant difference in age, gender, occupation, geographical location, treatment history, smoking history or diabetes history, and no statistical difference was observed between the clustered genotypes and individual genotypes in mono-drug resistance rate and multi-drug resistance rate.ConclusionThe mycobacterium tuberculosis isolates from Xingtai exhibit high genetic diversity. No correlation is observed between VNTR genotypes and drug resistance phenotypes in this study.

mycobacterium tuberculosis; genotype; variable number tandem repeats

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.010.037

河北省卫生厅科研项目(No 20150155)

050021 河北 石家庄，石家庄市第五医院检验科

戴二黑，E-mail:daieh2008@126.com

2017-02-17]