叶伟南 莫荣新 李少芳
·检验·
三种方法检测结核分枝杆菌复合群的比较分析
叶伟南1莫荣新2李少芳3
目的初步研究恒温扩增法(Isothermal amplification) 、环介导恒温扩增法(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)、改良罗氏培养基培养法在诊断结核分枝杆菌(Mtuberculosis,Mtb)复合群的临床验证和应用,评估这三种方法检测Mtb复合群的效能。方法选取肇庆市8县区的结核病防治机构2015年1月-2016年8月1496份痰标本,取587例痰培养阳性的培养物,同时进行恒温扩增法、LAMP、改良罗氏培养法检测Mtb复合群。结果罗氏培养法Mtb复合群阳性587例,阳性率39.2%(95%CI: 36.7%-41.7%),以此作金标准。恒温扩增法检测Mtb复合群阳性570例,阳性率38.1%(95%CI: 35.6%-40.6%),其灵敏度93.1%(95%CI: 90.8%-95.1%),特异度97.4%(95%CI: 96.2%-98.4%),阳性预期值95.9%(95%CI: 94.0%-97.4%),阴性预期值95.6%(95%CI: 94.1%-96.9%);LAMP检测Mtb复合群阳性578例,阳性率38.6%(95%CI: 36.1%-41.2%),灵敏度93.1%(95%CI: 90.8%-95.1%),特异度96.5%(95%CI: 95.2%-97.7%),阳性预期值94.6%(95%CI: 92.5%-96.3%),阴性预期值95.6%(95%CI: 94.1%-96.9%)。结论改良罗氏培养基培养法诊断Mtb复合群具有高度的准确度和特异性,恒温扩增法和LAMP具有等同效能,而LAMP实操比更优,更适合基层结核病实验室应用。
一、资料
1 液体培养菌株:收集2015年1月-2016年8月在结核病防治机构就诊的肺结核或疑似肺结核患者1496份痰标本, 取BBL MGIT 960培养阳性的587例菌株,其中肇庆市结核病防治所237例、各县区慢病站:高新区4例、高要105例、四会41例、广宁117例、怀集46例、德庆25例、封开12例。
2 仪器与试剂:罗氏培养基(培养和鉴定管)广东省结核病防治研究所提供,BBL MGIT 7mL Tubes由美国Becton Dickinson and Company提供,Mtb复合群核酸检测试剂盒(恒温扩增法),PCR荧光检测仪由广州迪澳生物科技有限公司提供。Mtb复合群核酸检测试剂盒(LAMP),由广州华锋生物科技有限公司提供。
二、方法
1 罗氏培养法:在磨菌瓶加入 1-2 滴10% 吐温 -80 ,无菌吸管尖端刮取新鲜菌落置于瓶中。旋紧瓶盖振荡器混旋 0.5-1分钟。加入少许灭菌的PBS。将悬浊液转移至比浊管中,加PBS 使其浊度与标准麦氏比浊管( MacFarland No.1 )一致。无菌操作逐步稀释至10-2mg/mL。22 SWG 标准接种环分别沾1环菌液,均匀接种至接种到硝基苯甲酸 ( PNB )及噻吩-2-羧酸肼( TCH )鉴定培养基,于36 ±1℃培养至四周观察记录结果,将TCH培养基上生长判定是NTM;PNB培养基上不生长判定是Mtb复合群。
2 恒温扩增法:Mtb核酸检测 (恒温扩增法)按照试剂盒说明书操作,将培养阳性的培养物1mL加入100μ离心去上清液,加1mL 生理盐水离心去上清液,加100μDNA提取液,100℃下加热10min,离心后提取2μL上清液到PCR管中混匀扩增,PCR荧光检测仪扩增检测。利用扩增曲线来判断结果,呈S型为阳性(含结核分枝杆菌),无S型则为阴性。每轮设阴阳性对照管。
3 LAMP:Mtb复合群核酸检测 (环介导恒温扩增法)按照试剂盒说明书操作,将培养阳性的培养物1mL离心去上清液,加入100μDNA裂解液,100℃下裂解10min,离心后提取2.5μL到HF反应管中,65℃反应60min,颠倒混匀数次后肉眼观察颜色变化判断结果,阳性绿色,阴性橙色。每轮设阴阳性对照管。
三、统计学方法
采用Microsoft Excel2007软件统计,SPSS 19.0统计学软件,三种方法比较采用四格表卡方检验,计数资料采用百分率及其95%CI表示,以P<0.05为差异有统计学意义。
一、罗氏培养法与恒温扩增法对比
罗氏培养法Mtb复合群阳性587例,阳性率39.2%(95%CI: 36.7%-41.7%),以罗氏培养法作为金标准,恒温扩增法阳性570例,阳性率38.1%(95%CI: 35.6%-40.6%),灵敏度93.1%(95%CI: 90.8%-95.1%),特异度97.4%(95%CI: 96.2%-98.4%),阳性预期值95.9%(95%CI: 94.0%-97.4%),阴性预期值95.6%(95%CI: 94.1%-96.9%)。两种方法结果比较,Kappa=0.91高于0.8,代表检测效果完全一致,(见表1)。
表1 罗氏培养法与恒温扩增法的一致性对比
注: Kappa=0.91 ,P=0.011 ,Z=35.26
二、罗氏培养法与LAMP对比
以罗氏培养法作为金标准,LAMP法阳性578例,阳性率38.6%(95%CI: 36.1%-41.2%),灵敏度93.1%(95%CI: 90.8%-95.1%),特异度96.5%(95%CI: 95.2%-97.7%),阳性预期值94.6%(95%CI: 92.5%-96.3%),阴性预期值95.6%(95%CI: 94.1%-96.9%),两种方法结果比较, Kappa=0.90 高于0.8,说明两种方法具有同等效能,(见表2) 。
表2 罗氏培养法与LAMP的一致性对比
注: Kappa=0.90,P=0.012 ,Z=34.82
三、恒温扩增法与LAMP
两种方法一致性比较, Kappa=0.97 高于0.8,代表两种方法检测结果完全一致,(见表3 ) 。
表3 恒温扩增法与LAMP的一致性对比
注: Kappa=0.97 ,P=0.006,Z=37.69
罗氏培养法,是鉴定Mtb复合群的传统方法,也是金标准,因其操作简单,经济,推广易,已在临床广泛应用[2-3]。原理是PNB在一定的浓度下(500μg)选择性抑制Mtb复合群生长,而不抑制NTM生长,达到Mtb复合群确认。该方法特异性和灵敏度较高,但检测期长(4周),不利于结核病早诊疗的原则。
目前国内外已应用PCR技术检测Mtb复合群[4-5],LAMP 法是日本学者 Notomi 在 PCR 技术的基础上创建的一种新的基因检测手段。恒温扩增法和LAMP的检测原理基本相同,引物均采用基因IS6110作为Mtb复合群检测靶标序列。Bst聚合酶及特异性引物在恒温条件下对Mtb DNA片段进行特异性扩增,测定其生成的产物来判断结果。新兴LAMP近年已在结核病防治方面得到广泛应用和研究[6-7]。
恒温扩增法和LAMP,在Mtb复合群诊断时,均具有灵敏度高,假阴性低,避免非特异性或污染造成的假阳性,(见表1、表2)。二种方法能显著缩短诊断时间,3小时可得结果,操作上均需加温、离心、扩增几个步骤。由表1和表2得出,两种方法在特异度、灵敏度以及诊断效能都具有完全一致性。本研究显示,恒温扩增法检测Mtb复合群的阳性率38.1%(95%CI: 35.6%-40.6%),与陈涛等[8]结果基本一致, 但需在开放性的PCR管中加样混匀,易产生气溶胶造成二次污染,还需配备专业的PCR荧光检测仪检测扩增曲线;而LAMP阳性率为38.6%(95%CI: 36.1%-41.2%),与沈会平的结果基本相同[9],其操作时加样到密封的HF反应管内扩增,过程完全在封闭的PCR管中进行,并与核酸染料SybrGreenⅠ结合,生成有色反应物,肉眼即可判断结果,且无需三个变控温度扩增,仪器的需求。因此, LAMP与另二种方法相比,操作快速、方便、简单、安全、经济有效,并可现场测定确认。进一步分析综合阳性率为38.7%(95%CI: 37.2%-40.1%),说明本地区感染Mtb复合群较为严重,待加强结核病诊治水平,建议各基层防治机构(慢性病防治站) 尽快提升实验室水平,及早应用快速、有效的LAMP分子生物学检测方法,为临床治疗提供有力依据。由于多种原因,笔者没有对耐多药的Mtb复合群专项研究,有待今后工作中完善。
上述三种方法在诊断Mtb复合群均具有高度的准确度和特异性,具有同等效能,而LAMP实操比更优,更适合于条件落后的基层结核病实验室推广应用。
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10.3969/j.issn.1009-6663.2017.010.047
肇庆市科技创新计划项目(No 00189901150419047)
1. 526020 广东 肇庆,肇庆市结核病防治所检验科 2. 520061 广东 肇庆,肇庆学院医院检验科 3. 526070 广东 肇庆,肇庆市鼎湖区人民医院二门诊部
WHO 2015年制定战略的目标,是在2015-2035年将结核病死亡率降低95%,将新发病例减少90%。而我国是全球22个高负担国家之一,仅次于印度,位居世界第二[1], 近年仍有近50万人感染耐多药Mtb。目前结核病防治诊断主要依赖临床表现,影象学和实验室的诊断,而Mtb复合群确诊以罗氏培养基培养法为主要的可靠手段。但Mtb生长缓慢的特性(6-8周),限制了检出率,随着实验室技术不断发展,出现了荧光定量PCR方法,恒温扩增法,LAMP等分子生物学检测方法诊断Mtb复合群。本研究通过对肇庆市结核病防治所2015年1月-2016年8月587份BBL MGIT 960培养阳性的培养物,用三种方法进行Mtb复合群检测,对结果进行比较分析和验证,进一步对分子生物学诊断Mtb复合群进行比较分析。
2017-02-04]