多重荧光LAMP法在食源性致病菌风险监测中的应用

田 浩李光耀 史笑娜

（河北东淼检测科技股份有限公司科研企划部，河北保定 071000）

·应用研究·

多重荧光LAMP法在食源性致病菌风险监测中的应用

田 浩*李光耀 史笑娜

（河北东淼检测科技股份有限公司科研企划部，河北保定 071000）

为解决食源性致病菌传统检测方法耗时长、工作量大问题，利用金黄色葡萄球菌femA序列和沙门氏菌invA序列设计了两套LAMP引物，添加荧光染料建立混合体系，通过恒温荧光检测仪对目标DNA进行扩增得到相关曲线，同时对扩增产物进行电泳分析，并且对100批次食品样品进行了效果验证。试验结果表明，该检测方法的普筛性与特异性良好，灵敏度达到71 CFU/mL，检测过程不易污染、耗时短。该方法可应用于部分食源性致病菌的快速初筛。

多重荧光LAMP法；致病菌；食品检测；快速检测

食源性致病菌指食品中能够引起人或动物疾病的致病性微生物。据统计，我国每年由食品中致病菌引起的食源性疾病报告病例数约占全部报告的40%～50%。

沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的传统检测方法均为增菌分离后生化鉴定，检测时间分别为4～8天和3～5天，并且每种致病菌需应用独立的检测方法单独进行检测，工作量大，检测周期长，且受到检测人员的专业、经验等多种因素限制，容易出现误判。目前食品安全问题日趋严重，食源性致病菌的风险监测与预警工作需要更加高效、快速、准确的检测方法。

LAMP法即环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification） 是 Notomi等于 2000年开发的一种新型的核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，在链置换DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）的作用下，60℃～65℃恒温扩增，15 min～60 min左右即可实现109～1010倍的核酸扩增。LAMP体系中加入荧光标记物（SYBR GREEN I核酸染液） 后可以通过荧光检测仪检测荧光信号，根据反应曲线判断反应体系中有无特异扩增。

目前的LAMP法主要为一个体系检测一种目标菌。因为我国的食源性致病菌风险监测工作种类多、范围大、时间紧，所以实现多种目标菌的同体系初筛就显得尤为重要。因此，本研究针对检测频率最高的金黄色葡萄球菌和沙门氏菌建立了一种多重荧光LAMP检测方法。

1 材料与方法

1.1 标准菌株

本试验参照食品安全国家标准GB 4789.28—2013《食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求》中附录D，采用食源常见标准菌株12株（均自中国工业微生物菌种保藏管理中心购买）：金黄色葡萄球菌ATCC25923，肠炎沙门氏菌CICC21482，阪崎肠杆菌CICC21560，表皮葡萄球菌CMCC（B）26069，铜绿假单胞菌 ATCC27853，致病性大肠埃希氏菌CICC10372，福氏志贺氏菌CMCC（B）51572，奇异变形杆菌 CMCC（B）49005，单增李斯特氏菌ATCC19115，乙型溶血性链球菌CICC10373，大肠杆菌ATCC25922，大肠杆菌O157 ATCC43889。

本研究均采用上述三代生长期标准菌株。

1.2 试验样品

50批次肉制品样品，保定翟老头食品有限责任公司提供；50批次豆制品样品，保定恒豆源食品有限公司提供。

1.3 材料与设备

Bst DNA聚合酶大片段、10×ThermoPol Buffer、SYBR GREENI染料，引物，生工生物工程（上海）股份有限公司。

3MPetrifilm致病菌测试纸，环凯微生物科技有限公司；细菌基因组DNA抽提试剂盒，广州迪澳生物科技有限公司；ZHSY-50S震荡培养箱，三洋电机(中国)有限公司；LGJ-12金属恒温浴，广州迪澳生物科技有限公司；移液器，芬兰艾斯玛特仪器设备有限公司；Hitachi*CR-GIII离心机，株式会社日立制作所；TT-HES-1电泳仪，Hercuvan生物科技有限公司；810自动凝胶成像系统，上海山富科学仪器有限公司；BHC1300IIA/B2生物安全柜，苏州净化设备有限公司；Deaou-308C恒温荧光检测系统，广州迪澳生物科技有限公司。

1.4 试验方法

1.4.1 模板DNA的制备

按照DNA抽提试剂盒使用说明对1.1中12种标准菌株进行DNA提取，制得模板DNA上清液。

1.4.2 LAMP引物的制备

选择金黄色葡萄球菌femA基因和沙门氏菌invA基因为靶基因。利用在线引物设计软件Primer Explorer version 4，设计本试验LAMP引物。引物通过NCBI（Blast）进行序列特异性的比对后进行引物PCR试验验证，以规避引物间的相互干扰，最终确定的引物序列见表1。

表1 LAMP引物序列

1.4.3 多重荧光LAMP法反应体系

25 μL反应体系组成：10×ThermoPol Buffer 2.5 μL， 10 μmol/L 外 引 物 1 （F3） 0.5 μL×2，10 μmol/L 外引物 2 （B3） 0.5 μL×2，10 μmol/L内引物 1（FIP） 1.0 μL×2，10 μmol/L 内引物 2（BIP） 1.0 μL×2，10 mmol/L dNTPs 4 μL，5 mol/L Betaine 2 μL，150 mmol/L MgSO4 0.5 μL，8 U/μL Bst DNA 聚合酶大片段 1 μL，SYBR GREEN I染料 0.5 μL，模板 DNA 2.0 μL，补水 6.5 μL。

恒温荧光检测系统条件：温度61℃，时间30 min。

1.4.4 普筛性分析

以金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌以及两者1:1混合菌株为目标菌进行荧光LAMP双重检测，观察恒温荧光检测仪数据曲线。应用DNA琼脂糖凝胶电泳检测LAMP扩增结果，分析多重检测时的普筛性。

1.4.5 特异性分析

应用本试验体系，以1.1中的非目标菌株为对照菌株进行荧光LAMP检测，通过试验曲线和电泳图分析特异性。

1.4.6 灵敏度分析

将1.4.4中使用的混合目标菌株用无菌生理盐水进行梯度稀释，得10-1、10-2、10-3、10-4菌株稀释液后进行LAMP检测，得扩增曲线。使用致病菌测试纸片对菌株稀释液进行定量检测，以验证灵敏度。

1.4.7 人工污染样品检测

将100批次检验样品随机人工污染10批次，然后对100批次样品进行致病菌初筛，以分析本方法在实际食品检测工作中的应用情况。

2 结果与分析

2.1 普筛性试验

目标菌株的荧光检测曲线见图1。

图1 多重荧光LAMP法的普筛性

由图1可知，目标菌株扩增曲线均呈指数增长，表明目标菌株实现了良好扩增。对LAMP反应产物进行琼脂糖凝胶电泳验证，电泳结果见图2。结果显示，目标菌株均得明亮条带，且条带位置正常及清晰。由扩增结果可知，荧光检测仪器显示结果与传统电泳结果显示一致，存在两套特异性LAMP引物的多重LAMP反应体系能够对混合目标菌株及单独目标菌株实现普筛。

图2 多重荧光LAMP法扩增电泳图（阳性）

2.2 特异性试验

由非目标菌株的荧光检测曲线（图略）分析可知，非目标菌株扩增曲线均未呈指数增长，表明非目标菌株未扩增。对LAMP反应产物进行琼脂糖凝胶电泳验证，电泳结果见图3。

图3 多重荧光LAMP法扩增电泳图（阴性）

结果显示，非目标菌株无明亮条带。对比图1、图2，说明本试验方法能够对目标菌株实现特异性扩增。

2.3 灵敏度分析

梯度混合目标菌株的扩增曲线见下页图4。

由图4可知，10-1～10-5稀释度的目标菌株在本试验体系下的扩增曲线均呈指数增长，表明均实现了良好扩增。经测试片检测可得10-5稀释度的金黄色葡萄球菌ATCC25923+沙门氏菌CICC21482混合菌悬液的浓度为71 CFU/mL，而荧光PCR方法的检测灵敏度约为103CFU/mL。由此可知，本方法较一些传统方法灵敏度高，能够实现目标菌株更大数量级的扩增。

图4 多重荧光LAMP法的灵敏度

2.4 人工污染样品实际应用

对100批次检验样品FX-001～FX-100进行风险初筛，并参照食品检测国家标准GB 4789.4《沙门氏菌检验》和GB 4789.10《金黄色葡萄球菌检验》，与传统检测方法测定结果进行对比。试验阳性结果统计见表2。

表2 阳性结果统计表

根据表2分析数据可知，本方法与国家标准要求的传统方法检测结果一致性达100%，未出现分子检测方法常见的假阴、阳性现象，表明本方法能够在我国现有食品安全要求水平下进行实际样品的检测，具有现实可行性。

3 讨论与结论

LAMP基础方法具有易污染、易呈假阳性、结果观察过于主观等缺点，而仪器的引进改善了这些问题。荧光LAMP检测仪通过收集荧光信号生成曲线，试验证明15 min～30 min左右即可完成曲线报告，较基础LAMP技术通过浊度或颜色进行结果观察更具客观性和简便性；同时检测过程闭盖操作，较基础LAMP技术通过后期添加染料的方法能有效减少交叉污染和假阳性结果的出现。

本试验通过设计、验证得到2种目标菌株的LAMP引物，均能实现特异性扩增，且不同引物间及混合反应过程中内部干扰较小，扩增结果分离效果较好，并且在100批次人工污染样品的检测中与传统方法检测结果统一性达100%，为更大规模多重检测方法的建立提供了现实依据。本文最终确定的LAMP体系要求试剂较容易获得；设备简单便携，规避了大型荧光PCR仪等仪器的使用。目前微生物标准物质研究水平较低，活菌标准物质不易获得，本方法灵敏度水平约为71 CFU/mL，相比其他微生物快速检测方法灵敏度较高。

本研究建立的多重LAMP检测方法能够同时对食源性金黄色葡萄球菌和沙门氏菌进行初筛，在实际的大规模致病菌风险监测中能够有效缩短检验时间和提高检验效率，避免严重食品安全事件的发生和扩散。

在食品检测领域，微生物检测项目根据其学科特点要求为不可复检，从而采用高级别抽样方案进行质量控制，由此决定了食源性致病菌的检测工作量大、操作繁琐、周期较长的特点。本研究从提高筛选效率、缩短试验周期方面进行突破，建立了多重荧光LAMP检测方法，结果证明其具有较好的普筛性、特异性和灵敏度，并具有一定的创新性和现实可行性。

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Application ofmultiple fluorescent LAMP reaction for foodborne pathogenic bacteria detection in risk monitoring

TIANHao*LI Guangyao SHI Xiaona
（Hebei dongmiaotest technologyCO.,LTD-scientific research and planningdepartment，Hebei Baoding 071000，China）

The problemoftraditional pathogenic bacteria detection method is time consuming and the large workload.The objective of the article is to solve the difficulty.Staphylococcus aureus and Salmonella were designed two sets of LAMP primers byinvAand femAsequences.The fluorescent was added tothe hybrid system.The target DNAgetted the amplification and the related curve through the constant temperature fluorescence detector.At the same time,the amplification products was analyzed through the electrophoresis apparatus，and 100 batches offood samples were tested in the end.The method has good screen and specificity.The sensitivityis 71 CFU/mL.The pollution and lowefficiencyis hard to happen in the process.The method can be applied to the beginning of the rapid screening of some food-borne pathogens.

multiple fluorescent LAMP reaction；pathogenic bacteria；food detection；rapid detection

TS207.4

A

1673-6044（2017）03-0023-05

10.3969/j.issn.1673-6044.2017.03.009

*田浩，男，1990出生，2012年毕业于河北大学生物工程专业，工程师。

2017-04-18