转录因子SOX7对前列腺癌PC-3细胞生物学活性的影响及其机制

郑斌，吴齐全，周克文，王钢，任雨，祁洪刚，朱伟智，翁国斌

（宁波市鄞州第二医院 泌尿外科，浙江 宁波 315100）

转录因子SOX7对前列腺癌PC-3细胞生物学活性的影响及其机制

郑斌，吴齐全，周克文，王钢，任雨，祁洪刚，朱伟智，翁国斌

（宁波市鄞州第二医院 泌尿外科，浙江 宁波 315100）

目的：探讨转录因子SOX7对前列腺癌PC-3细胞增殖、细胞周期、迁移和侵袭能力的影响及其机制。方法：采用脂质体法转染高表达SOX7重组质粒（pCDNA3.1-SOX7），以转染空质粒（Vector）作为对照，检测SOX7对PC-3细胞株增殖、细胞周期、迁移及侵袭的影响，并用Western blot法检测相关蛋白表达水平。结果：pCDNA3.1-SOX7显著抑制PC-3细胞增殖能力，并且诱导细胞周期发生G1期阻滞，同时，使Cylcin D1、E表达量明显下调。此外，pCDNA3.1-SOX7转染后，PC-3细胞迁移距离显著减少，穿透基质胶的细胞数量也显著降低，并且伴随着间质表型标记物MMP-2、MMP-9和N-cadherin蛋白表达减少，上皮标记物E-cadherin蛋白表达增加。结论：SOX7抑制前列腺癌PC-3细胞的增殖、周期、迁移及侵袭能力，其机制可能与调控这些细胞行为的相关蛋白表达有关。

SOX7；前列腺癌；增殖；迁移；侵袭

Abstract: Objective:To investigate the effects and mechanisms of transcription factor SOX7 on PC-3 cells proliferation, cell cycle, cell migration and invasion.Methods:PC-3 cells were transfected with highexpressed SOX7 recombinant plasmid (pCDNA3.1-SOX7) and further detected the changes of cell proliferation,cell cycle, migration, invasion, and related protein expressions.Results:After transfection with pCDNA3.1-SOX7, significant inhibition effects was shown in the PC-3 cell proliferation and G1/S cell cycle arrest, which were accompanied with decreased expressions of cyclin D1 and E. Furthermore, transfection of pCDNA3.1-SOX7 markedly decreased the cell migration distances and invasion capacity, with a reduction of the mesenchymal markers (MMP-2, MMP-9 and N-cadherin), however, the epithelial marker E-cadherin was increased.Conclusion:SOX7 inhibits PC-3 cell proliferation, cell cycle, migration and invasion through regulation of its related protein expressions.

Key words:SOX7; prostate cancer; proliferation; migration; invasion

前列腺癌为西方男性人群最常见的恶性肿瘤之一，近年来在我国的发病率与病死率呈逐年上升趋势[1-2]。临床上一般采取手术切除和放射疗法为主，然而肿瘤复发与转移问题已成为目前治疗的难点。上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）过程是肿瘤侵袭和转移的关键环节。在此过程中，上皮细胞表型转化为成纤维细胞的间质表型，上皮细胞间紧密连接相关蛋白表达下调，细胞外基质增多，抗凋亡能力增强，从而促进细胞迁移与侵袭[3]。SOX7作为转录调控因子SOX家族成员，特异性识别并结合靶基因5’-（A/T）（A/T）CAA（A/T）G-3’序列，影响基因转录水平，在调控胚胎发育过程中起重要作用[4]。近年研究表明，SOX7在肿瘤的发生发展过程中扮演重要角色[5-6]。SOX7在不同组织或细胞中具有表达差异性，在食管癌、胃癌以及胰腺癌中呈高表达状态，而在乳腺癌、前列腺癌、肺癌、肾癌和结直肠癌中呈现低表达[7-11]，在HeLa、HL60、S3、Raji、SW480、K562、MOLT-4、A549细胞株中呈不表达或低表达状态[7]。本课题组前期研究发现，相对于正常前列腺组织，SOX7在前列腺癌组织中呈低表达状态，并且与Gleason评分密切相关[12]。预实验结果表明，前列腺癌细胞株PC-3、DU145的SOX7表达量显著低于前列腺正常细胞株RWPE-1。为进一步研究SOX7对前列腺癌细胞生物学活性的影响及其机制，本研究用携带人过表达SOX7基因的重组载体（pCDNA3.1-SOX7）转染前列腺癌PC-3细胞，观察SOX7基因对PC-3细胞体外增殖、周期、侵袭及迁移能力的影响。

1 材料和方法

1.1 材料 人前列腺癌PC-3细胞株购自中国科学院上海细胞研究所。RMPI 1640无血清培养基、胎牛血清均购自美国Gbico公司；细胞周期蛋白E（Cyclin E）、细胞周期蛋白依赖性激酶2（cyclin dependent kinase 2，CDK2）、CDK4、CDK6、E-钙黏附蛋白（E-cadherin）、N-钙黏附蛋白（N-cadherin）鼠抗人单克隆抗体以及细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、GAPDH兔抗人单克隆抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）、MMP-9、SOX7、波形蛋白（vimentin）、纤维连接蛋白（fibronectin）兔抗人单克隆抗体购自英国Abcam公司；羊抗小鼠IgG二抗与羊抗兔IgG二抗购自武汉博士德生物科技有限公司。

1.2 细胞培养及分组 PC-3细胞接种于含10%胎牛血清的培养基中，37 ℃、5% CO2培养箱中饱和湿度培养。预实验结果发现，相对于Control未处理组，空质粒pCDNA3.1组（Vector组）对PC-3细胞SOX7蛋白表达量及细胞生物学活性均无显著性影响，因此，本研究仅比较pCDNA3.1-SOX7重组质粒组（pCDNA3.1-SOX7组）和空质粒pCDNA3.1组（Vector组）相关指标。

1.3 pCDNA3.1-SOX7质粒转染 根据GeneBank中SOX7基因的CDS碱基序列（NM_031439），委托上海吉玛生物科技有限公司合成pCDNA3.1-SOX7重组质粒。待PC-3细胞生长至50%～60%融合度时，按1∶3比例将质粒和脂质体混合液加入无血清培养基中进行转染，待6 h后更换为含10%胎牛血清的普通培养基。转染24 h后用于其他实验。

1.4 MTT增殖实验 60 mm培养皿中细胞汇合到80%～90%后，胰酶消化，完全培养基重悬细胞，计数并调整浓度至2×104个/mL，将稀释好的细胞悬液加到5块96孔板中，每孔100 μL，做5个复孔。在37 ℃、5% CO2培养箱中分别培养24、48、72、96 h后，每孔加入10 μL MTT溶液（5 mg/mL），在培养箱中继续培养4 h后，吸弃上清，加入150 μL DMSO溶液，于490 nm测各孔吸光度值并记录结果。

1.5 细胞周期检测 将PC-3细胞以1×105个/mL浓度接种于培养皿中，待细胞融合度达60%左右，脂质体法转染pCDNA3.1-SOX7质粒，24 h后用胰蛋白酶消化分装，离心，70%的冰乙醇沉淀后-20 ℃保存24 h，置于流式管中，避光加入400 μL PI/RNase染色液并混匀，30 min后置于流式细胞仪中检测细胞周期。

1.6 细胞划痕实验 将PC-3细胞以2.5×105个/mL浓度接种于6孔板中，待细胞长至融合度大于90%后，用200 μL枪头小心垂直于6孔板划一直线，37 ℃PBS清洗2次，24 h后倒置显微镜观察拍照，并计算迁移距离。

1.7 Transwell实验 PC-3细胞转染24 h后，消化，无血清培养基调整浓度至4×104个/mL，取200 μL加入铺有基质胶的Transwell小室上层，下室内加入600 μL含10%胎牛血清的培养基，待培养24 h后，取出上层小室，用消毒棉签擦除小室背面的基质胶及未穿膜细胞，置于甲醇固定10 min，0.1%结晶紫染色，PBS清洗2次。倒置显微镜下拍照，并计算穿膜数量。

1.8 Western blot实验 待细胞转染质粒后再培养24 h，37 ℃ PBS清洗2次，RIPA裂解，离心取上清，BCA法测蛋白浓度。电泳后湿转印至PVDF膜中，5%脱脂奶粉封闭60 min，4 ℃冰箱中孵育一抗过夜，TBST洗涤5次，二抗孵育60 min，显影曝光。

1.9 统计学处理方法 应用SPSS18.0软件将数据进行统计学分析。计量资料用 ±s表示，2组样本均数比较采用t检验。P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SOX7抑制前列腺癌PC-3细胞的增殖作用 转染pCDNA3.1-SOX7高表达质粒于PC-3细胞，经Western blot验证pCDNA3.1-SOX7重组质粒转染后其SOX7蛋白表达水平显著上调（见图1）。MTT实验显示，转染48 h后pCDNA3.1-SOX7组显著抑制了PC-3细胞的增殖能力（见图2）；流式细胞术检查发现，pCDNA3.1-SOX7组诱导PC-3细胞发生G1期阻滞（见图3）；Cyclin D1、E表达量下调，CDK2、4、6表达量无显著性改变（见表1）。

2.2 SOX7抑制前列腺癌细胞的迁移与侵袭作用划痕实验检测结果发现，转染pCDNA3.1-SOX7重组质粒24 h后，pCDNA3.1-SOX7组PC-3细胞的迁移距离显著性低于Vector组（见图4、表2）；Transwell试验结果发现，pCDNA3.1-SOX7组穿透基质胶的细胞数量也显著性低于Vector组（见图5、表2）；间质表型标记物MMP-2、MMP-9和N-cadherin蛋白表达减少，上皮标记物E-cadherin蛋白表达增加（见表1）。

图1 pCDNA3.1-SOX7重组质粒转染后SOX7蛋白表达水平变化

图2 pCDNA3.1-SOX7重组质粒转染后PC-3细胞增殖能力变化

3 讨论

近年来，关于高迁移率族蛋白结构域SOX家族基因与肿瘤发生发展的关系已成为研究热点。

已有研究发现，SOX7是wnt/β-catenin通路的负性调控因子，发挥着抑癌基因的作用。ZHAO等[13]发现，转染SOX7质粒后，细胞增殖受抑制，wnt/β-catenin转录水平降低，同时Cyclin D1和c-Myc蛋白表达下调，但转染缺失HMG-box结构域SOX7突变质粒后，并不能引起上述现象，因此认为，SOX7通过其本身的HMG-box结构域结合β-catenin并抑制其活性，从而下调β-catenin介导的增殖活性，扮演着抑癌基因的作用。此外，在人子宫内膜癌、卵巢癌、肝癌和乳腺癌的研究[8，14-17]中均有类似的报道。

细胞周期变化与细胞周期蛋白改变有关。其中Cyclin D/CDK4和Cyclin E/CDK2复合物促进细胞周期G1/S期的转换，Cyclin A/CDK2复合物调控G1/S和G2/M期的转换，而Cyclin B/CDK2复合物调控G2晚期进入有丝分裂期。据报道[18]，SOX7通过调控wnt/β-catenin通路活性，从而控制Cyclin D1和c-myc的表达，调控细胞增殖过程。本研究通过流式细胞术检测细胞周期，结果发现，SOX7抑制前列腺癌细胞的增殖能力，并且诱导细胞发生G1期阻滞，伴随着Cyclin D1、E的显著性下调，而CDK2与CDK4未见明显改变，由此可见，SOX7抑制的CylcinD1/CDK4、Cyclin E/CDK2复合物水平下调与细胞周期结果一致。因此，我们认为SOX7通过抑制Cyclin D1、E表达量，从而诱导细胞周期发生G1期阻滞，抑制细胞增殖。

图3 pCDNA3.1-SOX7重组质粒转染后PC-3细胞周期变化

SOX7抑制前列腺癌的转移过程可能与抑制肿瘤血管生成及EMT发生有关。有研究报道，在斑马鱼发育过程中，敲除SOX7与SOX18表达导致血管功能缺失[19]。新近研究发现，SOX7联合SOX17反馈调节于血管内皮生长因子信号，从而调控血管功能[20]。另外，EMT与恶性肿瘤的转移与侵袭密切相关[21]。CUI等[22]在胃癌的研究中也发现，SOX7水平与细胞浸润程度、淋巴结转移、TNM分期均具有相关性，认为SOX7在胃癌转移与浸润过程中扮演重要角色。ZHONG等[23]在研究SOX7与前列腺癌患者生存率的相关性时发现，SOX7在血清前列腺特异性抗原水平小于4 ng/mL的前列腺癌患者中有较高的表达量，并且在发生转移的患者中SOX7表达量显著性低于未发生转移的患者，因此认为，SOX7蛋白表达与肿瘤转移呈负相关。本课题组前期研究也发现了类似的现象。SOX7在前列腺癌组织中呈现低表达状态，而Gleason＜7的前列腺癌组织表达量大于Gleason≥7，说明SOX7表达量与前列腺癌浸润程度有关[12]。此外，我们发现高表达SOX7重组质粒转染后显著性抑制了细胞迁移与侵袭过程，伴随着间质表型标记物MMP-2、MMP-9和N-cadherin蛋白的减少和上皮标记物E-cadherin蛋白增加，这也说明SOX7转染后对于前列腺癌EMT过程具有抑制作用。

综上所述，SOX7抑制前列腺癌PC-3细胞的增殖、周期、迁移及侵袭能力，其机制可能与调控这些细胞行为的相关蛋白表达有关。

表1 pCDNA3.1-SOX7重组质粒转染后PC-3细胞周期相关蛋白和迁移/侵袭相关蛋白表达变化（n=3， ±s）

图4 pCDNA3.1-SOX7重组质粒转染后PC-3细胞迁移能力变化（×40）

图5 pCDNA3.1-SOX7重组质粒转染后PC-3细胞侵袭能力变化（×100）

表2 pCDNA3.1-SOX7重组质粒转染后PC-3细胞迁移及侵袭能力的变化（n=3， ±s）

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（本文编辑：丁敏娇）

Mechanisms and effects of transcription factor SOX7 on the biological activity of the prostate cancer PC- 3 cells

ZHENG Bin, WU Qiquan, ZHOU Kewen, WANG Gang, REN Yu, QI Honggang, ZHU Weizhi, WENGGuobin. Department of Urologic Surgery, Ningbo Yinzhou No.2 Hospital, Ningbo, 315100

R73-37；R737.25

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.09.011

2016-12-27

鄞州区科技计划项目；宁波市科技惠民项目（2017C50 058）。

郑斌（1982-），男，浙江宁波人，主治医师，硕士。

翁国斌，主任医师，教授，Email：ddwgb@aliyun.com。