PDTC对大鼠放射性肺损伤的保护作用及其机制

史殿魁，魏明

(1 沈阳市第七人民医院，沈阳110003；2 郑州大学第五附属医院)

PDTC对大鼠放射性肺损伤的保护作用及其机制

史殿魁1，魏明2

(1 沈阳市第七人民医院，沈阳110003；2 郑州大学第五附属医院)

目的探讨氢吡咯二硫代氨基甲酸酯(PDTC)对大鼠放射性肺损伤的保护作用及其对肺组织核因子κB(NF-κB)、细胞间黏附分子1(ICAM-1)表达的影响。方法将60只Wistar大鼠随机分为正常对照组、模型组和PDTC组，每组20只。模型组、PDTC组采用6 MV X射线照射双肺制作放射性肺损伤模型。PDTC组照射前3天开始皮下注射PDTC 10 mg/kg，持续至照射后30天。正常对照组和模型组同期注射等体积生理盐水。各组照射开始后8、24周处死后取肺组织，部分右肺组织行HE、Masson染色，观察肺组织病理变化；取右肺中上叶，检测羟脯氨酸表达；取左肺组织，称湿重，计算肺系数；取右肺下叶，检测肺组织ICAM-1、NF-κB mRNA表达。结果正常对照组右肺组织均未见明显异常。照射开始后8周，模型组肺组织病变以渗出为主，并出现少许胶原纤维沉积；照射开始后24周，肺泡壁增厚，肺泡腔明显变小，肺间质内各种细胞成分增多，可见明显的局部灶性纤维化区域。PDTC组照射开始后8、24周肺组织病变较模型组同期明显减轻，纤维化增厚主要集中在支气管及血管外膜，肺泡区域几乎未见明显纤维化。模型组照射开始后8、24周肺组织羟脯氨酸表达、肺系数均高于正常对照组(P均<0.05)，PDTC组各时间点肺组织羟脯氨酸表达、肺系数较模型组同时间点明显降低(P均<0.05)，但仍高于正常对照组同时间点(P均<0.05)。模型组照射开始后8、24周肺组织ICAM-1、NF-κB mRNA相对表达量均高于正常对照组同时间点(P均<0.05)，PDTC组各时间点肺组织ICAM-1、NF-κB mRNA相对表达量均较模型组同时间点降低(P均<0.05)，且高于正常对照组(P均<0.05)。结论PDTC能减轻放射性肺损伤大鼠的肺部炎症和纤维化程度，其机制可能与抑制NF-κB活化、调控ICAM-1表达有关。

放射性肺损伤；氢吡咯二硫代氨基甲酸酯；核因子κB；细胞间黏附分子1

放射治疗(简称放疗)是食管癌、肺癌、乳腺癌等恶性肿瘤的主要治疗手段之一。放疗常会造成正常肺组织不同程度损伤[1]，故其为胸部疾病放疗的主要限制性因素。目前放射性肺损伤的发生机制尚不清楚[2]。核因子κB(NF-κB)是一种控制编码细胞因子、细胞黏附分子的转录因子，细胞间黏附分子1(ICAM-1)是炎性反应过程中的一种重要的细胞因子，在放射性肺损伤过程中，二者表达均升高[3，4]；说明NF-κB、ICAM-1可能参与放射性肺损伤过程。氢吡咯二硫代氨基甲酸酯(PDTC)是一种人工合成的二硫氨基酸脂，具有抑制NF-κB活化、抗炎等作用[5]，其能否用于治疗放射性肺损伤目前尚不清楚。2015年7月～2016年12月，本研究探讨PDTC对大鼠放射性肺损伤的干预作用及其对肺组织NF-κB、ICAM-1表达的影响，旨在为临床放射性肺损伤的靶向治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 雌性Wistar大鼠60只，SPF级，8周龄，体质量(200±20)g，购自郑州大学动物实验中心，动物许可证号：SYXK(豫)2013-0005。PDTC，纯度99%，美国Sigma公司。HE染液及Masson染液，南京建成生物工程研究所；即用型SABC免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒、ICAM-1兔IgG多克隆抗体，武汉博士德生物工程有限公司；NF-κB多克隆抗体，美国Santa Cruze公司。医用直线加速器，德国西门子公司；TEC-2800型生物组织石蜡包埋机，意大利郝思琳公司；BX50型光学显微镜，日本Olympus公司；RY-2235型石蜡切片机，德国Leica公司；HPIAS-100型彩色高清晰度病理图像分析仪，西安华海电子有限公司。

1.2 放射性肺损伤模型制作及分组处理 所有大鼠适应性喂养1周，按随机数字表法分为正常对照组、模型组和PDTC组，每组20只。模型组和PDTC组制备放射性肺损伤模型，具体方法：腹腔注射2%戊巴比妥钠45 mg/kg麻醉，仰卧于固定装置上，胸部覆盖1 cm厚蜡块，以调整剂量分布。医用直线加速器6 MV X射线照射双肺，铅挡遮蔽纵隔，吸收剂量率2 Gy/min，照射野4 cm×3 cm，源皮距100 cm，每只照射8 Gy/d，连续照射5天，总剂量40 Gy。PDTC组从照射前3天开始，皮下注射PDTC溶液10 mg/kg，持续至照射开始后30天。正常对照组和模型组同期皮下注射等体积生理盐水。

1.3 相关指标观察 至照射24周，正常对照组、模型组、PDTC组分别存活20、10、14只。照射8、24周时，各组随机取5只，断颈处死，取双肺组织，-80 ℃冰箱保存备用。右肺组织用于观察肺组织病理形态变化、检测肺组织羟脯氨酸表达及ICAM-1、NF-κB mRNA表达，左肺组织用于计算肺系数。

1.3.1 肺组织病理变化 取部分右肺组织，4%多聚甲醛固定，常规脱水，完全脱水后石蜡包埋，室温静置1 h，-20 ℃冰箱冻存2 h，4 μm厚连续切片。将石蜡切片浸于水中完全舒展，置于烤箱中干燥1～2 h。然后分别行HE染色和Masson染色，显微镜下观察支气管黏膜及黏膜下肺组织充血、水肿和炎性细胞浸润、纤维化情况。

1.3.2 肺组织羟脯氨酸表达 取各组右肺中上叶(约50 mg)，去掉周围结缔组织，按照羟脯氨酸试剂盒说明，紫外分光光度计检测560 nm波长处吸光度(A)值，计算羟脯氨酸表达。羟脯氨酸表达(μg/mg)=[测定管A值-空白管A值]/[标准管A值-空白管A值]×标准管含量(5 μg/mL)×水解液总体积(10 mL)/肺组织湿重(50 mg)。

1.3.3 肺系数 取左肺组织称重，计算肺系数。肺系数=肺湿重/体质量×100%。

1.3.4 肺组织ICAM-1、NF-κB mRNA表达 采用RT-PCR法。取右肺下叶，异硫氰酸胍一步法提取肺组织总RNA，逆转录合成cDNA，然后进行PCR扩增。扩增引物由上海博亚生物有限公司设计合成。内参照采用β-肌动蛋白(β-actin)，引物序列：ICAM-1上游引物：5′-GGCGTCCATTTACACCTATTC-3′，下游引物：5′-TTCCTTTTCTTCTCTTGCTTG-3′，扩增片段长度382 bp；NF-κB上游引物：5′-CCCCATGGTTCAGAAGCTTG-3′，下游引物：5′-TTGAACGACCATCGATGAAA-3′，扩增片段长度410 bp；β-actin上游引物：5′-GGGCTGTATTCCCCTCCATC-3′，下游引物：5′-GTCACGCACGATTTCCCTCTC-3′，扩增片段长度272 bp。反应条件：95 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，56 ℃复性30 s，72 ℃延伸1 min，共33个循环，最后72 ℃延伸8 min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳后扫描拍照，用KODAKID型凝胶成像分析系统分析扩增产物灰度值。以目的基因与内参基因电泳条带校正光密度值的比值作为目的基因的相对表达量。

2 结果

2.1 各组肺组织病理形态变化 ① HE染色：正常对照组肺组织可见肺泡壁纤细，毛细血管壁完整，无渗出和出血，结构清晰；照射开始后8周，模型组肺组织病变以渗出为主，表现为肺间质及肺泡壁毛细血管扩张充血、出血、间质水肿致肺泡壁轻度增厚，同时伴有大量炎性细胞浸润；照射开始后24周，肺泡壁增厚，肺泡腔明显变小，壁内成纤维细胞、巨噬细胞和毛细血管数目增多，肺间质内各种细胞成分增多。PDTC组各时间点病变均较模型组明显减轻。见插页Ⅰ图3。②Masson染色：正常对照组肺组织未见明显纤维化；模型组肺组织在照射开始后8周开始即出现少许胶原纤维沉积，照射开始后24周可见明显的局部灶性纤维化区域，证实肺纤维化形成；PDTC组各时间点纤维化程度均较模型组减轻，纤维化增厚主要集中支气管及血管外膜，肺泡区域几乎未见明显纤维化。见插页Ⅰ图4。

2.2 各组肺组织羟脯氨酸表达及肺系数比较 见表1。

表1 各组肺组织羟脯氨酸表达及肺系数比较

注：与正常对照组同时间点比较，*P<0.05；与模型组同时间点比较，#P<0.05。

2.3 各组肺组织ICAM-1、NF-κB mRNA表达比较 见表2。

表2 各组肺组织ICAM-1、NF-κB mRNA相对表达量比较

注：与正常对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

3 讨论

美国放射肿瘤治疗协作组将发生在放疗90天内的放射性损伤称为急性放射性损伤，超过90天发生的放射性损伤称为晚期放射性损伤。早期放射性肺损伤主要为放射性肺炎，是一种由免疫介导的以淋巴细胞性肺泡炎为主的局部放射反应。晚期放射性肺损伤主要为放射性纤维化，是因靶细胞损伤后释放多种细胞因子，启动成纤维细胞进行增殖，导致胶原蛋白大量合成，最终使大量胶原沉积在肺间质。放射性肺损伤是一个复杂的病理生理过程，多种细胞因子在其发生、发展过程中起调控作用。NF-κB是一个多功能核转录因子，生物学活性广泛，且极易被激活，如TNF-α、射线等。激活后的NF-κB又可促进多种炎性介质(如细胞因子、ICAM-1、趋化因子等)转录，参与多种细胞因子、趋化因子和促纤维因子的合成，以及细胞外基质交联、成纤维细胞的分化和细胞增殖等过程[6]，从而在炎性反应中发挥重要作用。有研究发现，放射线可激活TNF基因，继而在NF-κB的激活过程中起重要作用[7，8]。Haase等[9]研究发现，增大照射剂量后，大鼠肺组织中NF-κB表达升高6倍以上。因此认为，NF-κB可能与放疗后肺组织慢性炎症和间质细胞纤维化有关。

PDTC为公认的NF-κB抑制剂，一方面可通过纠正氧化应激，减少NF-κB的诱导因素，进而抑制NF-κB的表达；另一方面可能通过干扰NF-κB激活的信号通路，抑制NF-κB活化，进而降低相关细胞因子的过度表达，显著减轻炎性反应的瀑布效应[10]。NF-κB是一个多功能核转录因子，激活的NF-κB可促进多种炎性介质转录，并参与多种细胞因子(如TNF-α、ICAM-1等)的合成，以及细胞外基质交联、成纤维细胞的分化和增殖过程，从而在炎性反应中发挥重要作用[11]。有研究表明，放射线可激活NF-κB，这可能与放射性肺损伤关系密切[12]。本研究结果显示，大鼠肺组织放射线照射后，肺组织中NF-κB被激活，并持续24周以上，这可能与后期慢性炎症和间质细胞纤维化有关。在这个过程中，不同细胞间及细胞与基质间的相互作用尤其重要，而黏附分子在其中扮演着桥梁的角色。ICAM-1主要存在于肺组织的肺泡上皮和毛细血管内皮上，射线可诱导肺血管内皮细胞产生ICAM-1，趋化白细胞黏附于内皮细胞，导致炎性反应。本研究正常对照组肺组织中ICAM-1 mRNA不表达或少量表达，模型组接受放射后ICAM-1在肺组织中表达明显增强，表明ICAM-1与肺损伤的炎性反应密切相关。研究发现，某些组织中NF-κB的活性改变与ICAM-1表达相关，在基础状态下少量NF-κB受到刺激后被激活，ICAM-1表达升高[13]。因此推测，在放射性肺损伤中NF-κB很可能在基因转录水平对ICAM-1的表达起着调控作用，从而影响后续的一系列炎症反应过程。我们推测，通过NF-κB抑制剂减少NF-κB的活化后，既可削弱NF-κB调控下的炎性反应，也可调控ICAM-1表达，以减轻肺泡炎性反应，继而减轻肺组织损伤。

总之，PDTC能够减轻放射性肺损伤大鼠肺部炎症及纤维化程度，其机制可能与抑制NF-κB活化、调控ICAM-1表达有关。

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魏明(E-mail： gushiweiming@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.32.012

R730.55

A

1002-266X(2017)32-0042-03

2017-02-03)