姜黄素对蛛网膜下腔出血大鼠脑血管功能及血清 PDGF、VEGF、EGFR 的影响*

郭二坤 米中波 梁朝辉 彭立威 徐 彬

（1.河北医科大学第二医院，河北 石家庄 050000；2.河北省赵县人民医院，河北 赵县 051530；3.新疆维吾尔自治区巴音郭楞蒙古自治州人民医院，新疆 巴音郭楞蒙古自治州 841000）

姜黄素对蛛网膜下腔出血大鼠脑血管功能及血清 PDGF、VEGF、EGFR 的影响*

郭二坤1△米中波2梁朝辉1彭立威1徐 彬3

（1.河北医科大学第二医院，河北 石家庄 050000；2.河北省赵县人民医院，河北 赵县 051530；3.新疆维吾尔自治区巴音郭楞蒙古自治州人民医院，新疆 巴音郭楞蒙古自治州 841000）

目的 观察姜黄素对蛛网膜下腔出血大鼠脑血管功能的影响及血清血小板源性生长因子（PDGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、表皮生长因子受体（EGFR）的变化。方法 将60只雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、姜黄素治疗组（姜黄素组），各20只。通过枕大池二次注血法建立蛛网膜下腔出血模型。所有造模成功的大鼠于第1次注血30 min后开始给药，具体方法如下：假手术组、模型组给予生理盐水；姜黄素组给予姜黄素2 mL。3组大鼠均采用灌胃的方式，连续给药7 d。术前、给药后1、3、5、7 d使用神经学评分评估大鼠神经功能。于给药后7 d取基底动脉进行HE染色，观察基底动脉横截面积和血管壁厚度。放射性免疫法分别测各组大鼠血清PDGF、VEGF、EGFR水平。结果 与假手术组相比，模型组神经学评分在给药1 d、3 d、5 d、7 d后均显著增加，差异有统计学意义（P＜0.05），而姜黄素组评分虽高于假手术组，但差异无统计学意义（P＞0.05）。与模型组相比，姜黄素组评分在给药1 d、3 d、5 d、7 d后均显著下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。基底动脉HE染色发现，模型组基底动脉发生管腔狭窄，壁厚增加，内皮细胞扭曲，内部弹性层卷积等形态学变化，而姜黄素组皱缩及增厚程度减轻。与假手术组相比，模型组横截面积均显著降低，血管壁厚度显著增加（P＜0.05）。而与模型组相比，姜黄素组横截面积显著增加，血管壁厚度显著降低（P＜0.05）。而假手术组与姜黄素组差异均无统计学意义 （P＞0.05）。放射性免疫法检测结果显示，与假手术组相比，模型组PDGF、VEGF、EGFR水平显著增加（P＜0.05）。而与模型组相比，姜黄素组PDGF、VEGF、EGFR水平显著下降（P＜0.05）。结论 姜黄素能改善蛛网膜下腔出血大鼠脑血管功能，并降低血清PDGF、VEGF、EGFR的表达。

姜黄素 蛛网膜下腔出血 脑血管痉挛 PDGF VEGF EGFR

蛛网膜下腔出血（SAH）的致残率和致死率都极高［1-2］。脑血管痉挛（CVS）是SAH患者最主要的并发症，常导致神经功能障碍迟发，是SAH患者死亡率居高不下的主要原因［3-4］。然而关于CVS的治疗策略仍未能有效改善SAH患者预后。因此，探究新的治疗方法，减轻CVS，改善SAH患者预后具有十分积极的意义。姜黄素作为一种研究最广泛的天然药物之一，对心脑血管疾病、癌症和神经功能障碍等多种疾病具有预防和治疗作用［5-6］。姜黄素的治疗作用部分通过姜黄素的抗氧化和抗炎作用介导。它可以调节多种信号通路、许多分子靶标和基因的表达。然而，姜黄素对SAH后引起CVS的影响尚未见报道。研究表明，许多生长因子参与此过程，如血小板源性生长因子（PDGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、表皮生长因子（EGF）及其受体EGFR、转化生长因子（TGF）等。本研究以雄性SD大鼠为研究对象，于枕大池二次注血建造SAH模型，探讨姜黄素对SAH大鼠脑血管功能的影响，并分析血清PDGF、VEGF、EGFR的变化。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 SPF级SD成年雄性大鼠，9～10周龄，体质量280～350 g，60只，购自昆明动物研究所，动物许可证号：SYXK（滇）K2015-0003。分笼饲养，每笼4只，于本实验室标准环境下术前适应性饲养7 d后，随机分为假手术组，模型组，姜黄素组3组，各20只。

1.2 试药及仪器 姜黄素（curcumin）购自西安昌岳生物科技有限公司，纯度为99%；水合氯醛购自Sigma；PDGF、VEGF、EGFR放射免疫试剂盒购自武汉博欧特生物科技有限公司。

1.3 造模方法 大鼠腹腔注射10%水合氯醛（300 mg/kg），麻醉后进行蛛网膜下腔出血模型制备。将大鼠置于俯卧位，切开项部，使环枕膜、寰枢弓、枕骨暴露，于股动脉取自体非肝素动脉血0.3 mL。将头皮针从环枕膜穿入枕在池抽取脑脊液0.3 mL，之后向枕大池缓慢注入自体非肝素血0.3 mL，注血后拔针并缝合伤口。大鼠俯卧，保持30°低头，维持30 min，使自体血充分进入基底动脉。48 h后，与之前方法一样，再次向枕在池内注入自体血0.3 mL。每次注血后观察大鼠生命体征，待其清醒后，置于笼内单独饲养。假手术组大鼠以注入0.3 mL无菌生理盐水代替自体血。

1.4 给药方法 所有造模成功的大鼠于第1次注血30 min后开始给药：姜黄素组给予姜黄素2 mL（将姜黄素用蒸馏水配制成10 mL/kg的液体）；假手术组、模型组给予等量生理盐水。3组大鼠均采用灌胃的方式，连续给药7 d。

1.5 神经功能缺损评分 参照Endo的方法使用神经学评分评估大鼠神经功能［7］。神经学评分如下：1级：无损伤，即大鼠在短时间内自由探索笼内环境，接近至少3个笼壁，没有运动障碍；2级：轻度损伤，即大鼠在笼子内延迟移动，没有接近所有笼壁但至少接近1个笼壁，动作迟缓；3级：中度损伤，大鼠有站立，但几乎无移动；4级：严重损伤，大鼠无法站立，瘫痪。分别于手术前、给药 1、3、5、7 d 分别进行评估。

1.6 标本采集与检测

1.6.1 基底动脉的横截面积和血管壁厚度检测 给药7 d后，大鼠麻醉并固定于手术台，进行基底动脉灌注。先滴入150 mL PBS，再灌以4%多聚甲醛（PFA）的0.1 mol/L PBS 100 mL。灌注完成后，立即取出含基底动脉的全部脑组织，并在相同的4%多聚甲醛中固定24 h。在每个基底动脉的近、中、远3个部分取材。解剖后，将各部分脱石蜡、水合、洗涤，并用HE染色进行染色。使用Image J软件（NIH）测量和计算每个基底动脉的横截面面积和血管壁厚度，作为评估CVS程度的指标。

1.6.2 放射性免疫法检测血清PDGF、VEGF、EGFR水平 给药7 d后，大鼠断尾取血2 mL，室温下静置4 h后，12000 r/min离心20 min，取上清，-20℃冷冻保存。按照试剂盒说明书（Biorbyt，上海），用放射性免疫法，分别测各组血清PDGF、VEGF、EGFR水平。

1.7 统计学处理 应用SPSS21.0统计软件。计量资料以s）表示，均数间的两两比较行独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠神经学评分比较 见表1。如图示，与假手术组相比，模型组神经学评分在给药1、3、5、7 d后均显著增加，差异有统计学意义（P＜0.05），而姜黄素组评分虽高于假手术组，但差异无统计学意义（P＞0.05）。 与模型组相比，姜黄素组评分在给药 1、3、5、7 d后均显著下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1 各组大鼠神经学评分比较（分）

表1 各组大鼠神经学评分比较（分）

与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05。下同。

组 别 n 给药后3 d 给药后5 d 给药后7 d假手术组 20 1.05±0.05 1.05±0.05 1.10±0.10术前 给药后1 d 1.05±0.05 1.10±0.10模型组 20 2.45±0.22* 2.90±0.22* 3.20±0.17*1.10±0.10 2.10±0.19*姜黄素组 20 1.10±0.10 1.35±0.15△ 1.60±0.20△ 1.90±0.22△ 2.10±0.24△

2.2 各组大鼠基底动脉变化比较 见图1，表2。假手术组显示无血管痉挛。模型组显示基底动脉形态学发生变化，管腔狭窄，壁厚增加，内皮细胞扭曲，内部弹性层卷积。与模型组相比，姜黄素组显示皱缩及增厚程度减轻。如表2示，各组大鼠基底动脉的横截面积和血管壁厚度变化。与假手术组相比，模型组横截面积均显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。与模型组相比，姜黄素组横截面积显著增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。模型组血管壁厚度显著高于假手术组，姜黄素组血管壁厚度显著低于模型组，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。假手术组与姜黄素组横截面积和血管壁厚度差异均无统计学意义（P＞0.05）。

图1 各组大鼠基底动脉电镜图（HE染色，500倍）

表2 各组大鼠基底动脉的横截面积和血管壁厚度比较

组 别 n假手术组 20横截面积（μm2） 血管壁厚度（μm）58654.69±10431.01 15.15±4.07模型组 20 19890.66±4956.81* 28.92±5.10*姜黄素组 20 57917.59±5234.66△ 18.01±6.06△

2.3 各组大鼠血清PDGF、VEGF、EGFR水平比较

见表3。结果示与假手术组相比，模型组PDGF、VEGF、EGFR水平显著增加（P＜0.05）。与模型组相比，姜黄素组PDGF、VEGF、EGFR水平显著下降，差异均有统计学意义（P＜0.05）。而姜黄素组与假手术组相关，差异无统计学意义（P＞0.05）。

表3 各组大鼠血清PDGF、VEGF、EGFR水平比较

表3 各组大鼠血清PDGF、VEGF、EGFR水平比较

PDGF（ng/L）654.69±31.01模型组 20 990.66±56.81*姜黄素组 20 637.59±34.66△组 别 n假手术组 20 VEGF（μg/L） EGFR（μg/L）1.15±0.07 90.52±5.72 1.92±0.10* 143.13±2.10*1.11±0.16△ 76.46±6.61△

3 讨 论

CVS被认为是SAH后高致残率和死亡率的主要原因［8］。50%～70%的SAH患者可以观察到CVS，且其中约50%的患者表现出明显的迟发神经功能损伤。虽然在过去几十年中CVS始终是研究SAH的重点，然而针对CVS的治疗策略未能有效改善患者预后。因此，探究减轻CVS并改善预后的新治疗方法具有积极的临床意义。CVS的发病机制虽然尚不清楚，但已有大量研究证实PDGF、VEGF、EGFR表达异常参与其中。

姜黄素是从热带植物姜黄根茎中提取出来的活性成分。临床研究表明，姜黄素在多种疾病中具有预防和治疗意义［9-10］。研究证明，姜黄素以多种信号通路为靶标，调控多种转录因子、炎性细胞因子、生长因子及其受体、抗细胞凋亡蛋白等表达，具有很强的抗炎、抗氧化和抗癌活性。研究表明，姜黄素可以通过抑制大鼠海马TNF-α和iNOS水平缓解蛛网膜下腔出血模型大鼠的神经炎症反应，改善模型大鼠的学习记忆能力［11］。然而，姜黄素对SAH后引起的CVS影响的研究尚未报道。本研究中对雄性SD大鼠于枕大池二次注血成功建造蛛网膜下腔出血模型后发现，模型组神经学评分在术后均显著增加，且模型组显示基底动脉形态学发生变化，横截面积显著降低，血管壁厚度显著增加。术后连续给予姜黄素治疗3 d后，姜黄素组神经学评分显著下降，基底动脉形态学变化改善，提示姜黄素治疗能有效缓解SAH后引起的CVS，且对脑神经功能损伤有治疗作用。

血小板源性生长因子PDGF调节血管损伤和心血管疾病发生过程中平滑肌细胞的迁移、增殖和胶原合成。研究表明，姜黄素阻断PDGF诱导的VSMC肌动蛋白-细胞骨架重组，减弱PDGF信号转导，并抑制PDGF与其受体的结合。姜黄素通过抑制PDGF-β受体和EGF受体的酪氨酸磷酸化，降低PI3K/AKT、ERK和JNK水平来中断PDGF和EGF信号传导。血液中PDGF表达水平与SAH后CVS的病理发展过程密切相关，PDGF可能是导致CVS发生的机制之一。

血管内皮生长因子VEGF是参与血管发生和血管生成的重要信号蛋白。VEGF的表达促进实体瘤的生长和转移，在结肠癌、乳腺癌、肺癌等几种癌症中都发现VEGF的过表达。研究表明，姜黄素能抑制GH3细胞和人垂体腺瘤细胞系中VEGF mRNA的合成和分泌，表明姜黄素对垂体肿瘤新生血管形成的抑制作用。研究发现，VEGF在SAH后早期表达水平增高，参与蛛网膜下腔出血后脑水肿、脑血管痉挛等脑损伤过程［12］。

表皮生长因子受体EGFR是I型跨膜酪氨酸激酶受体家族的一员，存在于除造血系统外的所有组织细胞膜表面。抑制EGFR信号传导被认为是许多类型疾病的主要促成因素［13-16］。姜黄素通过下调EGFR蛋白水平抑制内源性EGFR酪氨酸激酶活性，且抑制配体诱导的EGFR活化使前列腺癌细胞中EGFR信号传导下调。研究发现，EGFR高表达与大鼠脑出血发生、发展及脑出血引起的继发性脑损伤密切相关。沉默EGFR表达能够减轻脑出血大鼠脑组织病理损害，且通过抑制STAT3磷酸化而发挥脑神经保护作用［17-18］。

本研究中，术后模型组大鼠血清PDGF、VEGF、EGFR水平显著增加。而与模型组相比，连续给予姜黄素治疗7 d后，姜黄素组PDGF、VEGF、EGFR水平显著下降。提示蛛网膜下腔出血大鼠血清PDGF、VEGF、EGFR的表达异常，而姜黄素治疗能显著降低PDGF、VEGF、EGFR的表达水平。

综上所述，姜黄素能改善SAH大鼠脑血管功能，并降低血清PDGF、VEGF、EGFR的表达。然而，姜黄素对SAH后CVS改善作用及对生长因子调节作用的相关机制还有待深入研究，以期为其临床应用提供理论依据。

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Effect of Curcumin on Cerebral Vascular Function and Serum PDGF，VEGF and EGFR in Rats with Subarachnoid Hemorrhage

GUO Erkun，MI Zhongbo，LIANG Zhaohui，et al.The Second Hospital of Hebei

Medical University，Hebei，Shijiazhuang 050000，China.

Objective： To investigate the effect of curcumin on cerebral vascular function and serum PDGF，VEGF and EGFR in rats with subarachnoid hemorrhage.Methods：60 male SD rats were randomly divided into three groups： the shame group，the model group，and curcumin group （n=20 in each group）.A SAH model was induced by injection of blood twice into cisterna magna.At 30min before and after the two blood injictions，the shame group and the model group were given saline；curcumin group were given curcumin 2 mL （curcumin with distilled water prepared into 10 g/kg of the liquid）.Three groups of rats were fed with 7 days of continuous administration.Neurological score was used to assess neurological function in rats when preoperative and postoperative 1，3，5，7 days.HE staining was used to observe the diameter and cross-section area at day7 after dosing.The levels of serum PDGF，VEGF and EGFR were measured by radioimmunoassay.Results： Compared with the shame group，the neurological score of the model group was significantly increased after 1 d，3 d，5 d and 7 d.Compared with The model group，the score of curcumin group in the administration 1 d，3 d，5 d，7 d after the significant decreased （P<0.05）.The morphological changes of the model group were observed including luminal narrowing，increased wall thickness，distorted endothelial cells，and convolution of the internal elastic lamina，while slight decreased vasospasm was seen in the curcumin group.Histograms of the average cross-sectional areaof basilar artety showed significant decrease and the average wall thickness increased in the model group，compared with that in the shame group，which was attenuated by curcumin group.The levels of PDGF，VEGF and EGFR in the model group were significantly increased.Compared with the model group，the levels of PDGF，VEGF and EGFR in curcumin group were significantly decreased.Conclusion：Curcumin can improve the cerebrovascular function of rats with subarachnoid hemorrhage，and decrease the expression of serum PDGF，VEGF and EGFR.

Curcumin；Subarachnoid hemorrhage；Cerebral vasospasm；PDGF；VEGF；EGFR

R285.5

A

1004-745X（2017）09-1533-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.09.009

2017-06-23）

河北省医学科学研究重点课题计划项目（20130180）

△通信作者（电子邮箱：guoershen1966@163.com）