高效液相色谱法测定甲硫氨酸维B1氯化钠注射液中甲硫氨酸含量

肖 雷，许 龙

（1．安徽医科大学第一附属医院，安徽 合肥 230022； 2．安徽省先锋制药有限公司，安徽 合肥 230022）

高效液相色谱法测定甲硫氨酸维B1氯化钠注射液中甲硫氨酸含量

肖 雷1，许 龙2

（1．安徽医科大学第一附属医院，安徽 合肥 230022； 2．安徽省先锋制药有限公司，安徽 合肥 230022）

目的建立测定甲硫氨酸维B1氯化钠注射液中甲硫氨酸含量的高效液相色谱（HPLC）法。方法 采用COSMOSIL5 C18－MS－Ⅱ色谱柱（250 mm×4．6 mm，5 m）；以水为流动相，流速为1．0 m L／min；柱温为30℃ ，检测波长为228 nm。结果 甲硫氨酸质量浓度在70．94～638．46 g／mL范围内与峰面积线性关系良好（r＝0．999 9），平均回收率为100．03%，RSD为0．86%（n＝9）。结论 该方法准确、简便、快速、重复性好，适用于甲硫氨酸维B1氯化钠注射液中甲硫氨酸的含量测定。

高效液相色谱法；甲硫氨酸维B1氯化钠注射液；甲硫氨酸；含量测定

Abstract：Ob jective To establish an HPLC method for content determination of methiouine in Methiouine in Methiouine－Vitamin B1and Sodium Chloride Injection．M ethods The COSMOSIL5 C18－MS－Ⅱcolumn（250 mm×4．6 mm，5 m）was performed，the mobile phase was water，the flow rate was 1．0 mL／min，the temperature was set at 30℃，the detection wavelength was 228 nm．Results Methiouine showed a good linear in the concentration range of 70．94－638．46μg／mL（r＝0．999 9）．The average recovery of methiouine was 100．03%，and RSD was 0．86%（n＝9）．Conclusion The method is accurate，simple，rapid and reproducible，which can be used for the content determination of methiouine in Methiouine in Methiouine－Vitamin B1and Sodium Chloride Injection．

Key words：HPLC；Methiouine－Vitamin B1and Sodium Chloride Injection；methiouine；content determination

甲硫氨酸为人体8种必需氨基酸之一，人体自身不能合成，必须依靠外源补充。其在人体内与三磷酸腺苷(ATP)结合生成 S－腺苷氨酸，可促进肝细胞膜磷脂甲基化，减少肝内胆汁淤积，加强转硫基作用，有利于肝细胞恢复正常生理功能，促进黄疸消退和肝功能恢复；供给甲基，促进胆碱合成，后者与肝脏的脂肪结合形成卵磷脂，有调脂、促进肝脂肪代谢及保肝、解毒，可促进体内脂肪代谢的转运，防止脂肪沉积的作用。维生素B1在体内与焦磷酸结合成辅羧酶，参与糖代谢中丙酮酸和α－酮戊二酸的氧化脱羧反应，是糖类代谢所必需；缺乏时，氧化受阻形成丙酮酸，乳酸堆积影响机体能量供应。甲硫氨酸维B1注射液系肝病辅助用药，可改善肝脏机能，对多数肝脏疾病，如急慢性肝炎、肝硬化，尤其是脂肪肝有特别的疗效，能改善肝内胆汁淤积；可用于酒精、巴比妥类、磺胺类药物中毒时的辅助治疗；还可以改善营养，增强体质[1]。甲硫氨酸维B1目前上市的剂型有注射液、冻干粉针等，尚无大输液批准上市。本品临床应用不良反应少，经调查医院用药情况，多采用静脉滴注给药。因此，笔者对甲硫氨酸维B1氯化钠注射液进行了研究，原剂型执行的国家药品标准[2]采用电位滴定法测定甲硫氨酸的含量。本研究中建立了高效液相色谱（HPLC）法，可测定原化药注册5类新药甲硫氨酸维B1氯化钠注射液中甲硫氨酸的含量。现报道如下。

1 仪器与试药

1．1 仪器

LC－10A型液相色谱仪（日本岛津公司）；COSMOSIL5 C18－MS－Ⅱ色谱柱（250 mm×4．6 mm，5μm）；N－2000型双通道色谱工作站（浙江大学）；SPD－10Avp型紫外检测器（日本岛津公司）；AG135型双量程电子天平（Mettler Toledo公司）；KQ－250E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1．2 试药

甲硫氨酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号为140684－201507）；甲硫氨酸原料（注射用级，天津天安药业有限公司，批号为160204）；维生素B1原料（注射用级，湖北华中药业有限公司，批号为160115）；氯化钠（中盐宏博集团云梦云虹制药有限公司，批号为150228）；甲硫氨酸维B1氯化钠注射液[医院药剂科制剂室自制，批号为160801，160802，160803，规格为每瓶250 mL，含甲硫氨酸（C5H11NO2S）100 mg、维生素 B1（C12H17ClN4OS·HCl）10mg与氯化钠2．25g]；水为重蒸水。

2 方法与结果

2．1 色谱条件

色谱柱：COSMOSIL5 C18－MS－Ⅱ色谱柱（250mm×4．6 mm，5μm）；流动相：水；流速：1．0 mL／min；柱温：30℃；检测波长：228 nm；进样量：20μL。以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，理论板数以甲硫氨酸主峰计不得小于3 000。

2．2 溶液制备

供试品溶液：取甲硫氨酸维B1氯化钠注射液，作为供试品溶液。

对照品溶液：精密称取甲硫氨酸对照品适量，加水制成每1m L含0．4mg的溶液，即得。

空白辅料溶液：称取维生素B110mg、盐酸半胱氨酸（抗氧剂）75mg、氯化钠2．25 g，置250mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2．3 方法学考察

系统适用性试验：取2．2项下3种溶液各20μL，按2．1项下色谱条件测定，记录色谱图，结果见图1。可见，甲硫氨酸峰的分离度为9．8；理论板数以甲硫氨酸峰计算为9 645；空白辅料溶液（阴性样品）对甲硫氨酸的测定无干扰。故规定理论板数以甲硫氨酸计不得小于3 000。取供试品溶液20μL，按2015年版《中国药典（四部）》通则[3]，样品吸收峰高是噪音的3倍，作为其检测限，以不断稀释方法得出并计算，其最小检测限为1 ng。

图1 高效液相色谱图

线性关系考察：称取甲硫氨酸对照品35．47mg，精密称定，置50mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，精密量取1．0，3．0，5．0，7．0，9．0m L，分别置10m L容量瓶，加水稀释至刻度，摇匀。分别取20μL注入液相色谱仪，记录色谱图，计算峰面积。以质量浓度 X（μg／m L）对峰面积（Y）进行线性回归，得回归方程 Y＝1 760．14X－37．04，r＝0．999 9(n＝5)。结果表明，甲硫氨酸质量浓度在70．94～638．46μg／mL范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：精密吸取对照品溶液（0．400 8mg／mL）20μL，按“2．1”项下色谱条件连续进样6次，测定记录峰面积。结果的 RSD为0．41%(n＝6)，表明仪器精密度良好。

中间精密度试验：取样品（批号为160801），作为供试品溶液，由2人分别于不同时间采用不同仪器，分别精密量取20μL，按2．1项下色谱条件测定，记录峰面积。结果的 RSD为0．81%，表明方法中间精密度良好。

重复性试验：取样品（批号为160801），依法制备供试品溶液，分别精密量取20μL，共6次，按2．1项下色谱条件测定，记录峰面积。结果的 RSD为0．54%(n＝6)，表明方法重复性良好。

稳定性试验：取同一供试品溶液，分别于0，2，4，8，12，24 h时进样20μL，测定，记录色谱图，计算峰面积。结果的 RSD为0．65%(n＝6)，表明甲硫氨酸溶液在24 h内稳定。

回收率试验：分别称取干燥至恒重的甲硫氨酸原料（含量为98．70%）8，10，12mg，各3份，精密称定，分别置25mL容量瓶中，加处方量的辅料（维生素B1、盐酸半胱氨酸、氯化钠），加水溶解并稀释至刻度，摇匀，分别精密吸取上述溶液各20μL，按2．1项下色谱条件测定，计算回收率。结果见表1。

表1 回收率试验测定结果（n＝9）

2．4 样品含量测定

取 3批自制样品（批号分别为 160801，160802，160803）制备的供试品溶液和对照品溶液，按2．1项下色谱条件分别进样，记录色谱图。以外标法按峰面积计算样品中甲硫氨酸的含量。结果3批样品中甲硫氨酸的含量分别为标示量的100．65%，100．34%，99．75%（n＝3）。

3 讨论

3．1 测定波长选择

取甲硫氨酸对照品适量，加流动相溶解后，置紫外－可见分光光度计中，采用空白流动相，在195～400 nm波长范围内进行紫外扫描，结果228 nm波长处甲硫氨酸有最大吸收，空白对照试验表明，溶剂在228 nm波长处有极少量吸收，且保留时间短，不干扰主要成分和有关物质的检查。通过试验考察，测定波长在226～230 nm对含量测定结果无明显影响，参考文献[4]后选择228 nm为测定波长。另外，同时取维生素B1对照品溶液，在195～400 nm波长范围内进行紫外扫描，结果表明，维生素B1在234．5 nm及262．5 nm波长处有最大吸收。为了不影响本输液中2个主成分甲硫氨酸和维生素B1含量测定的准确性，本试验中未采用文献[5－6]报道的在同一色谱条件下同时测定两者的含量，而是分别进行含量测定方法学研究。

3．2 流动相选择

参考相关文献，分别选用以1mmol／L的己烷磺酸钠溶液（含0．2%三乙胺，用50%磷酸溶液调节pH至5．0） － 甲醇（85∶15）为流动相[4]，以缓冲液[取庚烷磺酸钠 0．25 g，用磷酸钠溶液（取磷酸钠 38 g，加水至1 000 m L使溶解，用磷酸调pH至2．1）溶解并稀释至1 000 m L]－ 乙腈（94∶6）为流动相[5]，以 0．005 mol／L庚烷磺酸钠溶液（磷酸调pH至3．0）－乙腈（92∶8）为流动相[6]，经多次摸索和比较，结果以水为流动相时峰形好，柱效高，各峰之间分离较好，故选此作为流动相。

此外，本试验中对原辅料的内控标准、原辅料相容性试验、溶液与包材的相容性试验等对该输液含量、有关物质和稳定性有影响的因素也进行了研究[7]。

试验结果表明，本研究中建立的测定甲硫氨酸维B1氯化钠注射液中甲硫氨酸（C5H11NO2S）含量的HPLC法操作简便，灵敏度高，干扰少，重复性好，准确，快速，可用于本品的质量控制。

[1]马春玉．甲硫氨酸维B1的临床应用及进展[J]．现代医药卫生，2012，28（6）：888－889．

[2]WS－10001（HD－1387）－2003，国家药品标准[S]．

[3]国家药典委员会．中华人民共和国药典（四部）[M]．北京：中国医药科技出版社，2015：59－61．

[4]纪 宇，刁 勇，王晨霞．高效液相色谱法测定甲硫氨酸维B1注射液的含量[J]．中国生化药物杂志，2005，26（4）：228－229．

[5]谢娟萍．HPLC法测定注射用甲硫氨酸维B1中甲硫氨酸和维生素B1的含量[J]．求医问药，2012，10（11）：852．

[6]张 斐，李小敏，刘春晖，等．RP－HPLC法测定甲硫氨酸维B1注射液的含量[J]．药学与临床研究，2007，15（1）：78－80．

[7]陈宇堃，薛巧如，梁蔚阳．ICP－MS法测定维生素B1注射液中硼、铝、砷、钡、铅的含量[J]．药物分析杂志，2016，36(3)：536－540．

Content Determ ination of M ethiouine in M ethiouine－Vitam in B1and Sodium Chloride In jection by HPLC

Xiao Lei1，Xu Long2
（1．The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei，Anhui，China 230022； 2．Anhui Piom Pharmaceutical Co．，Ltd．，Hefei，Anhui，China 230022）

R927．2；R977．4

A

1006－4931(2017)18－0014－03

10．3969／j．issn．1006－4931．2017．18．005

2017－05－09)

肖雷，男，副主任药师，主要从事医院临床药学工作，（电话）0551－62923245（电子信箱）xiaoleiayf＠126．com。

许龙，男，大学本科，主管药师，主要从事化学仿制药处方和工艺研究、质量研究及一致性评价工作，(电话)0551－65355036(电子信箱)163xul＠163．com。