天麻成分对羟基苯甲醛抗血小板聚集的作用机制研究

申 婷，肖 纯，向 彬，郭营营，李秀芳

（1．云南中医学院，云南 昆明 650500； 2．上海浦灵生物科技有限公司，上海 201203）

研究

天麻成分对羟基苯甲醛抗血小板聚集的作用机制研究

申 婷1，肖 纯1，向 彬1，郭营营2，李秀芳1

（1．云南中医学院，云南 昆明 650500； 2．上海浦灵生物科技有限公司，上海 201203）

目的探讨天麻成分对羟基苯甲醛抗血小板聚集的作用机制。方法 采用酶联免疫吸附法，检测不同浓度（320，80，20 mol／L）对羟基苯甲醛对二磷酸腺苷（ADP）诱导后大鼠体外富血小板血浆中环磷酸腺苷（cAMP）水平的影响；采用双波长Fura－2荧光分光光度法，测定对羟基苯甲醛对ADP诱导后家兔体外血小板胞浆钙离子浓度的影响；采用western blot，检测不同剂量（20，15，10 mg／kg）对羟基苯甲醛大鼠连续灌胃5 d后，对ADP诱导的血小板P2Y12受体表达的影响。结果 对羟基苯甲醛高、中浓度（320，80 mol／L）均能显著提高大鼠富血小板血浆 cAMP水平，与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0．01或 P＜0．05）；不同浓度（320，80，20 mol／L）对羟基苯甲醛对ADP诱导的家兔体外血小板细胞内钙释放与外钙内流均无明显影响，与阴性对照组相比，差异均无统计学意义（P＞0．05）；高剂量（20 mg／kg）对羟基苯甲醛能显著抑制ADP诱导的血小板P2Y12受体的表达。结论 天麻成分对羟基苯甲醛抗血小板聚集的作用是通过提高血小板cAMP水平、抑制血小板P2Y12受体的表达而发挥的。

天麻；成分；对羟基苯甲醛；抗血小板聚集；作用机制

Abstract：Objective To investigate the mechanism of the anti－platelet aggregation effect of p－Hydroxybenzaldehyde（PHBA） from Gastrodia elata．M ethods Enzyme－ linked immunosorbent assay（ELISA）was used to detect the effect of PHBA（320，80，20μmol／L）on the content of cyclic adenosine monophosphate（cAMP）in platelet－rich plasma（PRP）of rats induced by adenosine diphosphate（ADP）．The effect of PHBA on the external platelet cytosolic calcium concentration in rabbits induced by ADP was measured by dual－wavelength Fura－2 fluorescence spectrophotometry．The expression of P2Y12receptor induced by ADP was detected by western blotafter 5 days of continuous administration of PHBA （20，15，10 mg ／kg）rats．Results The high and medium concentrations（320，80 mol／L）of PHBA can significantly increase the levels of cAMP in PRP of rats，which were significantly higher than that in the model group，and the difference was statistically significant（P＜0．01 or P ＜0．05）．Different concentrations of PHBA （320，80，20μmol／L）had no obvious effect on intracellular calcium release and external calcium influx in ADP－induced rabbit platelets．High concentration of PHBA（20 mg／kg） could significantly inhibit the expression of platelet P2Y12receptor induced by ADP．Conclusion The mechanism of the anti－platelet aggregation effect of PHBA from Gastrodia elata is related to the increasing of platelet cAMP level and the inhibition of platelet P2Y12receptor expression．

Key words：Gastrodia elata；p－hydroxybenzaldehyde；anti－platelet aggregation；mechanism

血栓性疾病是缺血性脑梗死、心肌梗死、急性冠脉综合征等主要疾病的病理基础，研究表明，血小板的异常活化和聚集对于血栓的形成有重要作用，抗血小板药物可抑制血小板活化，对上述疾病有一定疗效[1－2]。目前，临床常用的抗血小板药物有阿司匹林（环氧合酶抑制剂）、氯吡格雷（二磷酸腺苷 P2Y12受体拮抗剂）和血小板膜糖蛋白Ⅱb／Ⅲa受体拮抗剂（阿昔单抗）等，但不良反应较多，且多因出血风险而使临床应用受限。因此，研究安全、有效的抗血小板聚集药物仍然是防治血栓性疾病的重点。对羟基苯甲醛（p－Hydroxybenzaldehyde，PHBA）是兰科植物天麻 Gastrodia elata Blume．的主要化学成分之一。前期研究显示，云南道地药材天麻的乙酸乙酯提取物具有较强的抗血小板聚集作用[3]。后续研究证实，PHBA是天麻抗血小板聚集活性成分之一，对于二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）诱导的家兔体外血小板聚集有显著的对抗作用[4]，但其机制尚不清楚。因此，本研究中对PHBA抗血小板聚集的作用机制进行了考察。现报道如下。

1 材料与方法

1．1 动物、仪器与试药

1．1．1 动物

日本大耳白兔30只，体质量2～2．5 kg，雌雄兼用，动物合格证号为SCXK（川）2013－24。雄性SD大鼠66只，清洁级，体质量250～300 g，动物合格证号为SCXK（川）2015－030。所有动物均由四川省医学科学研究院动物研究所提供，饲养条件：室温为（22±2）℃，相对湿度60%～70%，12 h明暗循环，自由饮食和饮水。

1．1．2 仪器

Infinite M 200 PRO型酶标仪（瑞士Tecan公司）；赛多利斯XS125A型分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；台式低速离心机（上海电机厂）；IISS－1B型数字式超级恒温浴槽（成都仪器厂）；台式低速离心机（上海电机厂）；半干转膜装置（TE－70，英国Amersham Biosciences公司）；UVP凝胶成像分析系统（Bio Spectrum，美国Spectrum公司）。

1．1．3 试药

PHBA（上海百灵威科技有限公司，批号为LB20K01，纯度为99%）；花生四烯酸（Arachidonic Acid，AA，日本TCI，批号为A0781）；ADP（Sigma公司，批号为091M7002V）；氯吡格雷（Clopidogrel，Santa Cruz Biotechnology，批号为G1713）；水合氯醛（分析纯，天津市瑞金特化学品有限公司，批号为20090814）；枸橼酸钠（天津市瑞金特化学品有限公司，批号为 A20120416）；Fura2－AM（Sigma公司，批号为010M 1351）；盐酸噻氯匹定（Sigma公司，批号为 039K1431）；磷酸盐缓冲液（PBS，北京鼎国昌盛生物科技有限公司，批号为28J001141）；TritonX－100（MP Biomedical，LLC，批号为MR28831）；Na2CO3（批号为 A20120313）；ADP试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号为04／2014）；Rabbit Anti－P2Y12（北京 Bioss公司，批号为 bs－12072R）；GAPDH（Beyotime公司，批号为 AG019）；Goat Anti－Rabbit IgG－HRP（Abmart公司，批号为＃M 21002）。

1．2 方法

1．2．1 对大鼠血小板cAMP水平的影响

富血小板血浆 （PRP）的制备：将36只SD大鼠随机分为溶剂对照组（给予1%吐温－80）、模型组（给予吐温 －80）、阳性对照组（给予氯吡格雷650μmol／L）及PHBA 3个浓度组（分别给予PHBA 320，80，20μmol／L）各6只，用10%的水合氯醛以3m L／kg的剂量腹腔注射麻醉大鼠，自颈总动脉取血，收集于一次性塑料试管中，采用3．2%枸橼酸钠抗凝，取血时试管内枸橼酸钠与取血量的比例为1∶9，取后立即颠倒混匀。血液于室温以1 000 r／min的速率离心10min，得上层液，即富血小板血浆（platelet rich plasma，PRP）。

各组给予相应药物或溶剂干预5 min后，以ADP为诱导剂，终浓度为12μmol／L，诱导血小板聚集，5min后所有样本中加入10mmol／L EDTA终止反应，4℃下以4 000 r／min的速率离心10min，收集上清液，按大鼠环磷酸腺苷（cAMP）酶联免疫检测试剂盒说明书操作，根据标准曲线计算出每个样品中cAMP含量。

1．2．2 对家兔血小板钙离子浓度的影响

负载血小板液制备：将30只家兔随机分为5组，即溶剂对照组（给予1%吐温－80）、阳性组（给予盐酸噻氯匹定终浓度为 167μmol／L）和 PHBA 3个浓度组（320，80，20μmol／L）。用10%的水合氯醛以 3 mL／kg的剂量腹腔注射麻醉家兔，自颈总动脉取血，收集于一次性塑料试管中，采用3.2%枸橼酸钠抗凝，同前制备PRP，PRP以3 000 r／min的速率离心15min后，弃上清液，沉淀下来的血小板用无钙HEPES缓冲液洗涤2次并调血小板数至400×109／L，加入Fura－2／AM，37℃恒温避光振摇负载。

双波长Fura－2荧光分光光度计法测定血小板细胞外钙内流：在上述HEPES液中加入CaCl2溶液孵育10min，调血小板数至400×109／L，取含Ca2+的HEPES细胞重悬液加入药物，37℃孵育5min，测定荧光值。用酶标仪测定荧光强度，发射波长（Em）为505 nm，发射光栅10 nm，激发波长（Ex）分别为340，380 nm，激光光栅5 nm，双波长下得荧光比值（F）。使细胞静息1 min后加ADP，5 min后加0.1%TritonX－100破坏其细胞膜，测饱和状态下得最大荧光比值（Fmax），最后加入EGTA络合钙离子，测得最小荧光比值（Fmin）。

双波长Fura－2荧光分光光度法测定血小板细胞内钙释放：取无Ca2+的HEPES细胞重悬液加入药物，37℃孵育5min后测定荧光值。用酶标仪测定荧光强度，Em为505 nm，发射光栅 10 nm，Ex分别为340，380 nm，激光光栅5 nm，双波长下得荧光比值（F）。使细胞静息1min后加ADP，5min后加0.1%TritonX－100破坏其细胞膜，测饱和状态下得最小荧光比值（Fmin），按公式[Ca2+]i＝Kd（R－Rmin)／（Rmax－R）（Ff2／Fb2）计算家兔血小板细胞在有无外钙下ADP诱导的血小板[Ca2+]i。

1．2．3 对大鼠血小板P2Y12受体表达的影响

将30只SD大鼠随机分为溶剂对照组（1%吐温－80），阳性组（氯吡格雷20mg／kg），PHBA高剂量（20mg／kg）、中剂量（15mg／kg）、低剂量（10mg／kg）组，各6只。连续给予相应受试药物5 d，于末次给药后30min，自颈总动脉取血，收集于一次性离心管中，采用3.8%枸橼酸钠抗凝，同前制备PRP。加入ADP常温下诱导，然后以3 000 r／min的速率离心15 min后，弃上清液，用PBS缓冲液洗涤沉淀的血小板2次。洗涤完后弃掉PBS，并根据细胞数量，加入适量的细胞裂解液，用微量移液器轻柔吹打数下使之充分混匀，冰上振荡30 min，4℃下置离心机中以14 000 r／min的速率离心5min；离心结束后，取上清液置新的预冷EP管中。根据BCA蛋白定量试剂盒法测定蛋白含量，并调平浓度。SDS－PAGE电泳：加入提前准备好的蛋白样品，每孔上样量为5μL，蛋白Marker上样量为5μL。经电泳、转膜、牛奶封闭后，一抗4℃过夜，二抗孵育1h，TBST室温摇床洗涤4次×5min，UVP凝胶成像系统显影。

1．3 统计学处理

2 结果

2．1 对大鼠血小板cAM P水平的影响

高、中浓度(320，80μmol／L)的PHBA能显著提高PRP中cAMP水平，与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。详见表1。

表1 PHBA对大鼠血小板cAMP水平的影响（±s，n＝6）

表1 PHBA对大鼠血小板cAMP水平的影响（±s，n＝6）

注：与模型组比较， P＜0．05， P＜0．01。

组别溶剂对照组模型组阳性对照组PHBA 高浓度组中浓度组低浓度组药物浓度（ mol／L）－ －650 320 80 20 cAMP水平37．29±4．22 22．51±3．19 37．53±1．60 36．88±1．01 32．76±3．82 37．29±4．22

2．2 对家兔血小板钙离子浓度的影响

不同浓度(320，80，20μmol／L)的PHBA对ADP诱导的家兔血小板细胞内钙释放与外钙内流无明显影响，与溶剂对照组相比，差异均无统计学意义(P＞0.05)，详见表2。

表2 PHBA对ADP诱导的家兔体外血小板聚集胞浆钙离子浓度的影响（±s，n＝6）

表2 PHBA对ADP诱导的家兔体外血小板聚集胞浆钙离子浓度的影响（±s，n＝6）

注：与溶剂对照组比较， P＜0．01。

组别溶剂对照组阳性组PHBA 高浓度组中浓度组低浓度组浓度（ mol／L）－167 320 80 20胞外流入[Ca2+]i（nmol／L）129．32±9．05 124．99±11．44 258．89±27．06 140．77±23．12 189．39±10．19释放内[Ca2+]i（nmol／L）229．68±16．64 139．02±12．74 267．46±27．24 221．13±28．73 245．08±19．78

2．3 对大鼠血小板P2Y12受体表达的影响

高剂量（20 mg／kg）PHBA能显著抑制血小板P2Y12受体的表达，其作用与阳性药相似。详见图1。

3 讨论

血小板是从骨髓中成熟的巨核细胞胞浆裂解脱落下来的、具有生物活性的小块胞质。生理情况下，血小板聚集对止血有重要作用；但在病理情况下，血小板的活化－聚集会导致许多疾病的发生和发展，是脓毒血症感染、动脉或静脉血栓形成、动脉粥样硬化、心肌梗死、中风等多种心脑血管疾病的重要发病机制之一[5－6]。此外，血小板聚集不仅会促进血栓形成，同时也释放促炎细胞因子，刺激白细胞募集到内皮细胞，加重炎性反应。因此，抗血小板活化与聚集药物的研究已成为血栓性疾病研究领域的热点，对于开发新药与防治血栓相关疾病具有重要意义[7]。

图1 PHBA对血小板P2Y12受体表达的影响

血小板活化聚集主要通过3条途径，其中ADP途径是影响血小板聚集的重要途径，但目前认为，3条途径最终均是通过降低血小板内cAMP水平并增加细胞内游离钙离子浓度而引起血小板活化聚集[8]。因此，本试验中主要以ADP为诱导剂，对PHBA抗血小板聚集的机制进行考察，结果表明，PHBA对ADP诱导的家兔血小板细胞内钙释放与外钙内流均无明显作用。腺苷酸环化酶可催化三磷酸腺苷（ATP）生成血小板cAMP，并经磷酸二酯酶（PDE）催化作用降解为5′－磷酸腺苷。因此，选择性血小板磷酸二酯酶抑制剂和腺苷酸环化酶激活剂均可升高血小板内cAMP水平，从而抑制血小板聚集[9]。试验结果显示，PHBA可提高血小板内cAMP水平，但其究竟是通过激活腺苷酸环化酶还是通过抑制磷酸二酯酶而减少cAMP的降解尚不清楚，有待进一步研究。P2受体是属于血小板表面的嘌呤类受体，也是抗血栓药物的重要靶点之一[10－14]。其中，P2Y12受体拮抗剂为重要的抗血小板聚集药物，临床应用广泛。其属于P2受体家族G蛋白偶联受体家族，主要分布在血小板膜表面。当P2Y12受体被激活后，可引起血小板维持持久聚集，并且通过与Gi偶联蛋白结合抑制腺苷酸环化酶的活性，从而导致cAMP水平降低，最终致使血栓性疾病的发生[15]。本研究结果表明，PHBA可明显抑制血小板P2Y12受体的表达，也间接说明了PHBA升高血小板内cAMP含量的原因，但PHBA是否能阻滞P2Y12受体还有待进一步研究。

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Mechanism of Anti－Platelet Aggregation of P－Hyd roxybenzaldehyde from Gastrodia Elata

Shen Ting1，Xiao Chun1，Xiang Bin1，Guo Yingying2，Li Xiufang1
（1．Yunnan University of TCM，Kunming，Yunnan，China 650500； 2．Prisys Biotechnologies Co．，Ltd．，Shanghai，China 201203）

R285．5

A

1006－4931(2017)18－0004－04

10．3969／j．issn．1006－4931．2017．18．002

2017－04－10；

2017－05－26)

国家自然科学基金[81303263]；云南省高层次中医药人才培养项目[10452300500]。

申婷，大学本科，研究方向为中药药理与应用，（电子信箱）1010516948＠qq．com。

李秀芳，博士研究生，研究方向为中药药理与毒理，（电话）0871－65918014（电子信箱）sofinelxf＠163．com。