鼻咽癌血清生物标志物研究新进展

秦铀 胡彦 杨辰苏 黄静 吴边 杨坤禹

作者单位：430022 武汉 华中科技大学同济医学院附属协和医院肿瘤中心

鼻咽癌血清生物标志物研究新进展

秦铀 胡彦 杨辰苏 黄静 吴边 杨坤禹

作者单位：430022 武汉 华中科技大学同济医学院附属协和医院肿瘤中心

杨坤禹，医学博士，教授，主任医师，博士研究生导师。现任华中科技大学附属协和医院肿瘤中心副主任、头颈肿瘤科主任。兼任中华医学会肿瘤放射治疗分会放射生物学组委员，湖北省抗癌协会常务理事，湖北省抗癌协会淋巴瘤专业委员会主任委员，湖北省抗癌协会鼻咽癌专业委员会副主任委员，湖北省抗癌协会肿瘤放射治疗专业委员会常委等。担任全国高等医学院校十三五规划教材英文版《Oncology》副主编。先后承担国家自然科学基金项目和湖北省自然科学基金项目5项，近5年来以第一作者或通信作者发表SCI论文10余篇。

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是一种起源于鼻咽部上皮细胞的恶性肿瘤，发病率居头颈部恶性肿瘤首位。NPC发病部位隐蔽、早期无典型症状，且个体疗效差异较大，故寻找高特异性和高敏感性的生物标志物，对其早期诊断、疗效和预后判断具有重要意义。本文就近年来鼻咽癌血清生物标志物的研究进展作一论述，旨在为临床诊断和治疗提供帮助。

鼻咽肿瘤；分子标志物；EB病毒；miRNA

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是一种起源于鼻咽部上皮细胞的恶性肿瘤，具有明显的种族差异性和地域特征，我国南方尤其多见。肿瘤生物标志物是指在肿瘤发生和增殖过程中，由肿瘤细胞合成和释放或由肿瘤对机体细胞反应而产生，标志肿瘤存在和生长的一类物质，包括蛋白质、激素、酶（同工酶）、多胺、癌基因产物等。肿瘤标志物可用于肿瘤筛查、诊断、鉴别诊断、疗效评价及预后判断等。寻找高特异性与高敏感性的血清生物标志物，对提高NPC早期诊断率以及疗效具有重要的临床意义。本文对近年来报道的血清NPC分子标志物作一论述。

1 与EB病毒相关的血清生物标志物

NPC 发病与EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）感染密切相关，1969年Ito等［1］报道，NPC患者血清中EBV抗体滴度明显增高，引起国内外学者广泛关注。随着研究不断深入，发现EBV多种产物，包括DNA片段、蛋白质、miRNA、抗体等在NPC患者中均显著增高，与NPC患者诊断、分期、治疗与预后相关。

1.1 EBV DNA片段

NPC细胞死亡后，整合在DNA中的EBV片段释放入血，通过Real-time PCR可检测到血清中的EBV DNA拷贝数。近年国内外研究发现，EBV DNA可作为NPC患者筛查、分期、随访复查以及预后判断的生物标志物。

1.1.1 循环EBV DNA检测 1999年Lo等［2］首次采用Real-time PCR技术检测55例NPC患者血清EBV DNA拷贝数，发现96%的患者EBV DNA阳性，平均水平为21 058拷贝数/mL，晚期患者较早期患者水平更高。国内外多个研究小组采用该技术重复了该项研究，其敏感性为53%～96%，特异性为88%～100%。分析发现，影响EBVDNA敏感性的原因主要有以下3个：⑴用于提取DNA的血清或血浆量偏少。在敏感性不足90%的4项研究中，血清或血浆均少于200 μL［3-8］。⑵临床分期。在Leung等［9］的研究中，早期和晚期NPC患者敏感性分别为90%和98%。⑶病理类型。在一些NPC高发地区，以非角化未分化型为主，该型患者癌组织含EBV基因组，但一些西方国家WHOⅠ型患者较多，而该型癌组织中不含EBV基因组［10］。意大利一项研究显示［6］，WHOⅢ型患者EBV DNA检测敏感性明显高于其他病理类型。目前考虑EBV DNA特异性较高，而如何提高其敏感性具有重要的临床意义。

1.1.2 EBV DNA筛查早期患者 决定NPC患者疗效的最重要因素是治疗前分期。但目前超过75%的患者确诊时已为局部晚期或发生转移［11］。因此，筛查早期NPC患者成为提高NPC疗效的一个重要途径。Chan等［12］检测1 300例无临床症状志愿者EBV DNA和EBV壳抗原（EBV capsuid antigen，VCA）IgA，发现3例早期NPC患者，且EBV DNA均为阳性，只有1例VCA IgA阳性，说明EBV DNA敏感性更好。此外，0.2%的志愿者EBV DNA阳性，但鼻咽镜活检阴性，这些患者目前仍在随访。

1.1.3 治疗前EBV DNA的临床意义 在第一项EBV DNA检测研究中，Lo等［2］发现Ⅲ～Ⅳ期患者EBV DNA中位水平是Ⅰ～Ⅱ期者的8倍，提示EBV DNA可能反映肿瘤负荷大小，且该研究结论被Ma等［13］证实。因此，有学者提出假说，EBV DNA与肿瘤负荷密切相关，或可用于预测患者预后。Lo等［2］研究显示，EBV DNA拷贝数每升高10倍，疾病相关死亡率随之增高1.6倍，提示预后不良。接下来的研究进一步证实了EBV DNA的预后预测价值，发现EBV DNA较UICC临床分期系统更能预测患者的总生存期［14-15］。其中，台湾Lin等［16］研究提示，EBV DNA水平较高的患者更易发生远处转移，提示预后不佳。Wang等［17］2010年进一步研究发现，放化疗过程中EBV DNA的清除速率可作为复发转移的预测因子，因此建议临床动态监测EBV DNA拷贝数水平。

1.1.4 治疗后EBV DNA的临床意义 EBV DNA是由NPC肿瘤细胞直接释放，患者体内肿瘤细胞如全部被清除，理论上EBV DNA亦应该转为阴性。故有学者提出治疗结束如检测到EBV DNA，是否提示肿瘤残存。Chan等［18］研究发现，治疗结束时患者EBV DNA水平对OS和DFS具有明显的预测价值。该研究发现治疗后EBV DNA>500拷贝数/mL，其复发风险升高11.9倍。该研究结果亦被其他研究证实［19-20］。Lin等［16］研究小组数据亦显示，治疗结束DNA拷贝数检测仍然阳性的患者，其复发率明显高于阴性患者。在患者随访过程中，如患者血清EBV DNA拷贝数再次升高，往往提示治疗失败，应积极随访，早期明确患者治疗失败部位［2，17］。

1.2 EBV编码miRNA

miRNA是一种小的内源性非编码RNA，与肿瘤发生发展密切相关。EBV编码miRNA（EBV-miRNA）通过调控宿主与病毒自身基因表达，在NPC发病中扮演重要角色［21］。依据 miRBase提供的数据［22-23］，EBV可编码40余种miRNA，包括EBV-miR-BHRF1-1～3和EBV-miR-BART1～22。据报道，从NPC组织和癌旁组织中提取的总miRNA中，EBV-miRNA含量分别为23.3%和 0.1%［24］。Hirai等［25］研究发现，在 31 例 NPC患者中，EBV BamHI-W DNA 片段、miR-BART2-5p、miR-BART17-5p和miR-BART18-5p诊断鼻咽癌的敏感性和特异性分别为100%/100%、85%/85%、60%/95%和25%/100%。最重要的是，治疗后11例肿瘤残留或复发患者中，5例DNA片段检测阳性，6例miR-BART17-5p检测阳性，提示miR-BART17-5p或可作为NPC治疗后监测复发的重要生物标志物。Zhang等［26］检测NPC患者3种EBV-miRNA，分别是miR-BART7、miR-BART13和miR-BART3。结果发现miR-BART7和miR-BART13明显增高，两者联合诊断NPC的预测价值高达90%，且治疗后，miR-BART7与miR-BART13转为阴性，提示这两种miRNA可能作为NPC诊断与疗效预测的生物标志物。

1.3 EBV抗体

EBV 核抗原（EBV nuclear antigen 1，EBNA1）是EBV潜伏感染时表达的产物，在EBV游离体DNA复制过程中起关键作用［27-28］。Coghill等［29］采用 ELISA对NPC高危人群进行血清EBNA1 IgA水平检测，发现其敏感性达80%，但假阳性率为40%。VCA是EBV增殖感染时表达的结构抗原。Chen等［30］报道，血清VCA-IgA敏感性和特异性分别为83%和88%，若联合其他检查，可提高其诊断的准确率。Lin等［31］研究发现，同时检测VCA-IgA、过氧化物酶2和过氧化物酶3的血清水平，可将特异性提高至95%。Li等［32］将VCA-IgA和抗EBV糖蛋白gH/gL抗体的血清水平结合，发现验证组敏感性和特异性分别为91.2%和96.5%。认为血清EBNA1和VCA-IgA水平的检测虽可为NPC早期诊断提供帮助，但其敏感性和特异性仍有待提高。

EBV包膜糖蛋白350（gp350）是EBV中含量最高的糖蛋白，细胞感染EBV后会产生大量抗gp350抗体，故gp350常应用于EBV疫苗的研究。Coghill等［33］对NPC高危人群进行检查发现，B淋巴细胞产生的EBV中和性抗体和抗gp350抗体在健康人体内呈高表达状态，说明抗gp350抗体可作为NPC的保护性分子标志物，在NPC早期诊断中，或可作为一个阴性参考指标。

2 其他生物标志物

2.1 乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）

乳酸脱氢酶是一种糖酵解酶，存在于机体所有组织细胞的细胞质内。Zhou等［34］一项回顾性研究报道465例接受调强放疗治疗的NPC患者，局部晚期患者LDH水平明显更高；进一步行多变量分析显示，LDH可作为总生存率、无瘤生存率、无远处转移生存率的预测因子；在治疗后远处转移的患者中，肝转移NPC患者LDH水平明显高于其他部位转移的患者。Chen等［35］回顾分析1 188例NPC患者，发现治疗前LDH是一项简单、经济、有效的疗效预测指标，且与患者肿瘤负荷呈正相关。因此，推荐LDH作为NPC患者检测的常规指标。

2.2 C 反应蛋白（C-reactive protein，CRP）

C反应蛋白作为一种炎症标志物，是指机体受到感染或组织发生损伤时，血浆中急剧升高的一类蛋白质。Tang等［36］研究发现，CRP表达水平与NPC患者总生存期、无瘤生存期和无远处转移生存期呈负相关，若联合血清EBV DNA检查，可提高晚期NPC患者预后评估的准确性。此外，Tao等［37］对791例行调强放疗的NPC患者进行回顾性分析发现，血清CRP/白蛋白比值越高，患者总生存期越短。

2.3 miRNA

Ye等［38］通过miRNA微阵列分析发现，miR-24-3p在NPC患者血清外泌体呈高表达，可通过抑制成纤维细胞生长因子11（recombinantfibroblastgrowthfactor11，FGF11）基因表达降低T细胞ERK磷酸化水平和调节信号传导及转录激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）信号通路，最终抑制T细胞增殖和Th1、Th17细胞分化，并诱导调节性T细胞亚群分化。实验证明，FGF11表达水平与CD4和CD8阳性的肿瘤浸润性淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocyte，TILs）密度呈正相关，可提示预后良好，而miR-24-3p则是提示NPC患者预后不良的潜在分子标志物。

2.4 血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）

血管内皮生长因子是血管内皮细胞特异性的肝素结合生长因子，可促进体内新生血管形成。研究表明，VEGF高表达与NPC淋巴结转移、复发和预后不良相关，可作为NPC早期转移的潜在标志物。Tan等［39］对338例NPC患者进行分析发现，VEGF-460T/C基因多态性可提示预后不良，或能成为一个理想的新型治疗靶点。

2.5 内皮素-1（endothelin-1，ET-1）

内皮素-1是可有效收缩血管的生物活性肽和乏氧微环境中的血管生成因子，在实体瘤的生成和扩散中起重要作用，其含量与NPC临床分期呈正相关。Mai等［40］采用夹心酶联免疫法对62例晚期NPC患者和19名正常人血浆进行检测发现，晚期NPC患者治疗前ET-1血浆浓度明显增高，且可提示治疗后远处转移及不良预后。同时，Luo等［41］发现ET-1受体可通过提高趋化因子受体4的表达水平促进NPC转移。

3 结语

随着新方法、新技术的应用，新的血清生物标志物不断被发现，其中EBV DNA已广泛应用于NPC临床诊疗，是协助诊断与鉴别诊断、观察疗效与预测预后的可靠血清分子标志物。但是，EBV DNA检测同样存在敏感性不高，各单位检测标准不统一等问题。优化EBV DNA检测方法，提高其敏感性；研究新的特异性与敏感性更高的生物标志物；联合检测多种分子标志物，建立复合诊断模型，以提高NPC的诊断与治疗水平，是下一步的研究方向。

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［2017-05-13收稿］［2017-06-10修回］［编辑 罗惠予］

R739.63

A

1674-5671（2017）04-05

10.3969/j.issn.1674-5671.2017.04.06

国家自然科学基金资助项目（81372435）

杨坤禹。E-mail：yangkunyu@medmail.com.cn