鼻咽癌组织中P16、CD4和CD8的表达及其与预后的关系

李文婷 秦永辉 王若峥

作者单位：830011 乌鲁木齐 新疆医科大学附属肿瘤医院1病理科，2头颈放疗科

鼻咽癌组织中P16、CD4和CD8的表达及其与预后的关系

李文婷1秦永辉2王若峥2

作者单位：830011 乌鲁木齐 新疆医科大学附属肿瘤医院1病理科，2头颈放疗科

王若峥，博士后，教授，主任医师，博士研究生导师，享受国务院特殊津贴专家。现任新疆维吾尔自治区肿瘤防治研究所副所长、新疆维吾尔自治区肿瘤学重点实验室主任、新疆医科大学附属肿瘤医院放疗中心主任、放疗教研室主任。兼任中华医学会放射肿瘤学学会委员，国家肿瘤质控中心放射治疗质控专家委员会委员，中国抗癌协会放射治疗专业委员会委员，中国医师协会放射治疗专业委员会常务委员，中国抗癌协会鼻咽癌专业委员会委员，新疆医学会放射肿瘤学分会主任委员，新疆放射治疗质量控制中心主任委员，新疆医学会肿瘤学分会常务委员，西部放射治疗协会常务理事，牛津大学客座研究员，科技部专家库评审专家，教育部学位论文评审专家等。担任《中华放射肿瘤学杂志》、《中华放射与防护杂志》、《实用癌症杂志》、《新疆医科大学学报》、《新疆医学》等杂志编委。从事放疗专业30年，在肿瘤放射治疗领域有独到之处。近5年主持国家自然基金地区联合重点项目1项、国家科技部国际合作资助项目1项、国家自然基金科学基金资助项目2项；2016年获新疆维吾尔自治区科技进步奖一等奖，2013年获新疆维吾尔自治区科技进步奖二等奖，2014年获新疆维吾尔自治区优秀论文二等奖。主编教材1部、专著1部，参编教材2部；以第一或通信作者发表SCI论文14篇，核心期刊论文60余篇。

目的探讨鼻咽癌组织中P16、CD4和CD8的表达及其与鼻咽癌患者临床特点及预后的关系。方法采用免疫组化法检测133例鼻咽癌组织中P16、CD4和CD8的表达情况，分析其表达与鼻咽癌临床病理特征及预后的关系。结果133例鼻咽癌组织中，P16的阴性表达率为75.9%（101/133），阳性表达率为24.1%（32/133）；CD4的阴性表达率为75.2%（100/133），阳性表达率为 24.8%（33/133）；CD8 阴性表达率为 76.7%（102/133），阳性表达率为 23.3%（31/133）。P16与CD4在鼻咽癌组织中的表达差异有统计学意义（P<0.05），二者呈正相关趋势（r＝0.206，P=0.094）；P16、CD4和CD8在不同性别、年龄、民族、吸烟史、肿瘤家族史、临床分期患者中的表达差异均无统计学意义（P>0.05），但P16表达在不同性别患者（P=0.069）、CD8表达在不同临床分期患者（P=0.085）中的差异均为临界值；P16、CD4、CD8阴性表达和阳性表达患者5年总生存率差异无统计学意义（P>0.05），但CD4阳性表达与阴性表达患者5年无瘤生存率（P=0.002）及5年无局部复发生存率（P=0.024）差异均有统计学意义。结论 P16、CD4和CD8表达与鼻咽癌患者性别、临床分期有关。CD4阳性表达患者预后可能更佳，联合检测P16、CD4和CD8在鼻咽癌中的表达或可作为判定鼻咽癌患者生物学行为及预后评估的依据。

鼻咽肿瘤；P16；CD4；CD8；临床病理学；预后

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是发生于鼻咽腔顶部和侧壁的恶性肿瘤，已知的病因包括EB病毒感染、遗传、环境因素等，放疗是首选的治疗方法。P16是细胞周期素依赖性激酶（cyclin dependent kinases，CDKs）抑制剂［1］，P16 蛋白表达情况可能是推测机体HPV感染状态的证据之一［2］。CD4+T细胞识别外源性抗原，与MHCⅡ类分子结合，活化的效应细胞主要为Th细胞。CD8+T细胞识别内源性抗原，与MHCⅠ类分子结合，活化的效应细胞为细胞毒性T细胞（CTL或Tc）［3］。研究显示，肿瘤中病毒抗原可引起机体抗肿瘤应答，触发肿瘤特异性CD4+辅助分子和CD8+细胞毒性T细胞活化与增殖［4］。本研究采用免疫组织化学方法检测133例鼻咽癌患者活检组织中P16、CD4和CD8的表达，并探讨其与鼻咽癌患者临床特点及预后的关系。

1 材料与方法

1.1 标本

选取并整理新疆医科大学附属肿瘤医院病理科2010～2014年收集的鼻咽癌活检石蜡包埋组织133例。所有病例经核实无重复，年龄、性别、民族、病理诊断等临床病理资料完整，组织标本均经HE染色，进行组织学观察和复诊。组织学类型参照2006年WHO头颈部肿瘤病理学和遗传学分类标准［5］，临床分期采用中国鼻咽癌2008分期标准。

1.2 方法

所有组织标本均经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，3～4 μm厚连续切片，进行免疫组织化学染色。免疫组化染色所用的抗体 P16（克隆号 16p04JC2，1∶50）、CD4（克隆号 EP204，1∶100）、CD8（克隆号 SP16，1∶150）、PV-6000免疫组化测试剂盒均购自北京中杉金桥生物公司。常规脱蜡、脱水，EDTA（PH8.0）高压修复，DAB显色，苏木素复染，光镜下观察。具体实验步骤按试剂盒说明进行。每组实验均设置阳性及空白对照，以PBS代替一抗作阴性对照，P16以宫颈鳞癌作为阳性对照，CD4和CD8以鼻咽组织中淋巴细胞作为内对照。

1.3 结果判定

P16定位于细胞核和细胞质，以肿瘤细胞核或细胞质出现棕黄色颗粒为阳性，肿瘤间质不着色。CD4、CD8定位于细胞膜，以肿瘤细胞膜出现棕黄色颗粒者为阳性，肿瘤间质不着色或部分淋巴细胞着色。P16、CD4、CD8结果判读依据染色阳性细胞数计算，结合文献［6-7］及本实验结果，P16表达≥5%肿瘤细胞核或细胞质着色为阳性，<5%肿瘤细胞核或细胞质着色为阴性。CD4、CD8表达≥10%肿瘤细胞膜着色为阳性，<10%肿瘤细胞膜着色为阴性。

1.4 统计学处理

采用SPSS 17.0统计软件进行分析，计数资料比较采用χ2检验，相关性分析采用Person相关分析，采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，生存曲线比较行log-rank检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 P16、CD4和CD8在鼻咽癌组织中的表达

133 例鼻咽癌组织中EBV原位杂交的感染率为84.96%（图1A～B）。P16在133例鼻咽癌组织中阴性表达率为75.9%（101/133），阳性表达率为 24.1%（32/133）。P16在鼻咽癌组织中呈阴性表达肿瘤成分及肿瘤间质均不着色（图1C），以同批实验中宫颈鳞癌组织作对照呈阳性表达（如图1D）；P16阳性表达呈棕黄色细颗粒表达在细胞质（图1E）或细胞核（图1F），肿瘤间质均不着色。

CD4在鼻咽癌组织中阴性表达率为75.2%（100/133），阳性表达率为 24.8%（33/133），CD4 蛋白呈棕黄色细颗粒表达在鼻咽癌组织的细胞膜（图1G），肿瘤组织及间质均不着色为阴性表达（图1H）；CD8阴性表达率为76.7%（102/133），阳性表达率为23.3%（31/133），CD8蛋白呈深棕黄色细颗粒表达在鼻咽癌组织的细胞膜（图1I），肿瘤组织及间质均不着色为阴性表达（图 1J）。

图1 P16、CD4和CD8在鼻咽癌组织中的表达

2.2 P16、CD4和CD8表达与鼻咽癌临床病理特征的关系

133 例鼻咽癌患者年龄15～91岁，中位年龄为50.3岁。P16、CD4和CD8在不同性别、年龄、民族、吸烟史、肿瘤家族史、临床分期患者中的表达差异均无统计学意义（P>0.05），但P16表达在不同性别患者（P=0.069）、CD8表达在不同临床分期患者（P=0.085）中的差异均介于临界值，见表1。

表1 P16、CD4、CD8表达与鼻咽癌患者临床病理特征的关系

（续表）

2.3 鼻咽癌组织中P16表达与CD4、CD8表达的关系

鼻咽癌组织中P16及CD4均阴性表达的患者最多，P16及CD4均表达阳性者最少，P16在鼻咽癌组织中的表达与CD4在鼻咽癌组织中的表达差异有统计学意义（P<0.05），两者呈正相关趋势（r=0.206，P=0.094）。P16与CD8在鼻咽癌组织中的表达差异无统计学意义（P>0.05），两者呈正相关趋势（r=0.064，P=0.090）。

2.4 P16、CD4和CD8表达与鼻咽癌患者预后的关系P16、CD4、CD8阴性表达和阳性表达患者5年总生存率（overall survival，OS）比较差异无统计学意义（P>0.05），见图2。CD4阳性表达患者5年无瘤生存率（disease-free survival，DFS）显著高于阴性患者，差异有统计学意义（92.6%vs 45.4%，P=0.002），见图 3。P16、CD4、CD8阴性表达和阳性表达患者5年无远处转移生存率（distant metastasis-free survival，DMFS）比较差异无统计学意义（P>0.05），见图4。CD4阳性表达患者5年无局部复发生存率（local relapse-free survival，LRFS）高于阴性患者，差异有统计学意义（96.3%vs 71.2%，P=0.024），见图 5。P16、CD4 和 CD8表达与鼻咽癌患者预后的关系见表2。

图2 P16、CD4、CD8表达与鼻咽癌患者5年OS的关系

图3 P16、CD4、CD8表达与鼻咽癌患者5年DFS的关系

图4 P16、CD4、CD8表达与鼻咽癌患者5年DMFS的关系

图5 P16、CD4、CD8表达与鼻咽癌患者5年LRFS的关系

表2 P16、CD4和CD8表达与鼻咽癌患者预后的关系

3 讨论

鼻咽癌的发生发展是多因素、多阶段、多基因变异积累及相互作用的过程，EBV感染是其明确的病因之一。研究证实，头颈部鳞癌中可通过P16蛋白表达推测HPV感染情况，是影响头颈部鳞癌患者预后的独立因素［8］。而鼻咽癌中EBV与HPV双重感染及交互作用的研究报道较少，目前尚未得出一致的结论［9-10］。

目前研究发现P16蛋白表达阳性患者大多提示预后不良。韦明壮等［11］认为P16蛋白低表达与鼻咽癌的发生发展有关。Lin等［12］发现P16阴性表达的肿瘤细胞放化疗的疗效更佳。Rosales-Pérez等［6］研究发现发生远处转移、复发以及短期无复发生存均可能与P16蛋白阴性表达有关。Wen等［13］研究表明，检测P16表达可作为指导鼻咽癌诊断和预测疗效的指标。成潇等［14］研究发现肺癌中HPV相关蛋白表达与CD4+和CD8+细胞表达呈正相关。本研究中，P16在133例鼻咽癌组织中的阴性表达率为75.9%，在鼻咽癌组织中的表达与CD4在鼻咽癌组织中的表达差异有统计学意义（P<0.05），二者呈正相关趋势，可能由于p16基因在对抗EBV感染时机体免疫机制的差异所导致，但目前此类交互作用的研究尚未见报道。

有研究检测鼻咽癌患者外周血中CD4和CD8相关T细胞比例的表达情况评估鼻咽癌患者的临床疗效。本研究133例鼻咽癌组织中EBV感染率为84.96%，CD4、CD8表达在不同性别、年龄、民族、吸烟史、肿瘤家族史、临床分期等患者中的差异均无统计学意义（P>0.05），但CD8在不同临床分期患者中的表达差异介于临界值（P=0.085），这可能由于地域差异、研究样本选择、研究方法不同以及遗传易感性等差异造成，也可能与肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL）有关，不同肿瘤的TIL细胞中CD4+T细胞、CD8+T细胞比例差异较大，但大多以CD8+T细胞为主［15］。

在分析P16、CD4和CD8表达与鼻咽癌患者预后的关系时，尚未发现P16、CD4、CD8表达阴性、阳性患者5年OS差异有统计学意义（P>0.05），但5年DFS CD4阳性组（92.6%）高于 CD4阴性组（45.4%），5年LRFS CD4阳性组（96.3%）高于CD4阴性组（71.2%），提示CD4表达阳性患者可能预后更佳。因此，通过联合检测鼻咽癌组织中P16、CD4和CD8的表达情况，探讨其表达与鼻咽癌患者临床特点及预后的关系，或有助于鼻咽癌患者生物学行为及预后评估。但由于本研究病例数较少，要明确P16、CD4、CD8与鼻咽癌临床特点及疗效预后的关系，尚需继续扩大样本量并增加其他研究指标进一步探讨。

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［2017-05-24收稿］［2017-06-16修回］［编辑 罗惠予］

Clinical significance of P16，CD4 and CD8 in nasopharyngeal carcinoma

Li Wenting1，Qin Yonghui2，Wang Ruozheng2
（1Department of Pathology，2Department of Radiotherapy of Head and Neck ，Affiliated Tumor Hospital of Xinjiang Medical University，Urumqi 830011，P.R.China）

Nasopharyngeal neoplasm；P16；CD4；CD8；Clinical pathology；Prognosis

Wang Ruozheng.E-mail：wrz8526@vip.163.com

R739.63

A

1674-5671（2017）04-06

10.3969/j.issn.1674-5671.2017.04.08

新疆维吾尔自治区科技计划资助项目（201554142）；新疆维吾尔自治区重点实验室开放课题资助项目（2015KL021）

王若峥。E-mail：wrz8526@vip.163.com

【Abstract】ObjectiveTo examine the clinical significance of P16，CD4 and CD8 in patients with nasopharyngeal carcinoma.MethodsClinical history and immunohistochemical expression of P16，CD4 and CD8 were investigated in 133 patients with nasopharyngeal carcinoma.ResultsNegative expression rates were 75.9%for P16，75.2%for CD4 and 76.7%for CD8；the corresponding positive expression rates were 24.1%，24.8%and 23.3%.Expression of P16 positively correlated with that of CD4 （P<0.05）.Expression of P16，CD4 or CD8 did not differ significantly with gender，age，nationality，smoking history，family history of cancer or clinical stage.Nevertheless，trends were observed for gender-dependent expression of P16（P=0.069）and clinical stage-dependent expression of CD8（P=0.085）.Patients negative or positive for expression of P16，CD4，or CD8 did not differ significantly in 5-year overall survival rate（P>0.05）.However，CD4 positivity was associated with significantly higher rates of 5-year disease-free survival（P=0.002）and 5-year local recurrence-free survival（P=0.024）than CD4 negativity.ConclusionP16，CD4 and CD8 expression is associated with the clinical characteristics of nasopharyngeal carcinoma.CD4-positive patients may have better prognosis.Joint detection of P16，CD4 and CD8 expression in nasopharyngeal carcinoma may help guide classification，treatment and prognosis prediction of patients.