雏鸭坦布苏病毒分离鉴定及全基因序列分析

提金凤，李志杰，李 舫

(山东畜牧兽医职业学院，山东潍坊 261061)

雏鸭坦布苏病毒分离鉴定及全基因序列分析

提金凤，李志杰，李 舫

(山东畜牧兽医职业学院，山东潍坊 261061)

山东潍坊地区某鸭场养殖的21日龄樱桃谷鸭突然发病，病鸭主要表现翅腿瘫痪等神经症状，排黄绿色或黄白色稀粪，病死率5%左右。为了确定发病鸭群感染病原的种类，首先采集病死鸭肝脏，处理后接种9日龄～11日龄SPF鸡胚进行病原分离。其次，对分离的病原RT-PCR扩增和序列测定，MEGA5绘制系统发育进化树，DNA Star软件分析核苷酸同源性。结果表明，通过SPF鸡胚分离到一株坦布苏病毒(TMUV)，命名为TMUV-SDWF。该病毒株基因组全长为10 990 nt，编码1个含3 426个氨基酸的多聚蛋白。系统发育进化树分析显示，TMUV-SDAG毒株属于Ⅰa分支。核苷酸同源性分析表明，TMUV-SDSG与GenBank上公布的16株不同TMUV分离株核苷酸同源性高达97.0%～99.8%。成功分离鉴定一株鸭坦布苏病毒并对其进行了遗传进化分析，为鸭坦布苏病毒弱毒或灭活疫苗的筛选制备及该病毒分子流行病学的研究奠定了基础。

鸭坦布苏病毒；核苷酸同源性分析；多聚蛋白

坦布苏病毒(Tembusu virus,TMUV)最早于1955年从蚊子体内分离得到，属于黄病毒科、黄病毒属中的那他亚病毒群[1-3]。坦布苏病毒感染产蛋鸭后主要引起产蛋率急剧下降，出血性卵巢炎[4-5]；雏鸭感染后主要表现为扭脖、瘫痪等神经症状，病死率较高[6-7]。TMUV能否通过特殊的途径感染人类，还尚不明确，这成为人们密切关注的问题。该病毒于2010年4月在我国东南养鸭地区出现，宿主范围广泛，可以感染多种禽类，如北京鸭、绍兴鸭、金定鸭、樱桃谷鸭、缙云麻鸭及坎贝尔鸭等品种，也可感染鸡、鹅、麻雀等家禽或野禽[8-10]。试验表明，TMUV还能通过脑内途径感染小鼠[8,11]。该病毒传播迅速、传播范围广，不到1年时间，我国绝大多数养鸭地区均有该病的发生，给养鸭业造成了严重的经济损失[11]。TMUV主要通过呼吸道、消化道感染禽类，研究表明该病毒还能通过种蛋垂直传播，导致种蛋孵化率、出壳率下降，死胚及弱雏增多[12]。

由于TMUV感染的宿主广泛，传播速度快，为了在临床上有效的防控该病，本研究从发病鸭场中采集病料，进行TMUV的分离鉴定及生物信息学分析，为TMUV弱毒或灭活疫苗的筛选制备及分子流行病学的研究奠定基础并提供部分理论数据[13]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料、细胞及鸡胚 山东潍坊某商品肉鸭基地养殖21日龄樱桃谷鸭发病，主要表现为翅腿瘫痪等神经症状，腹泻，排黄绿色或黄白色稀粪，病死率5%左右，采集病死鸭肝脏进行病原分离。9日龄SPF鸡胚，购自山东省农业科学院SPF鸡场；BHK-21、Vero等细胞,来自山东省畜牧兽医职业学院动物疫病监测中心；5日龄雏鸭,购自山东潍坊某鸭场。

1.1.2 试剂 Random Premier、DNA凝胶纯化试剂盒、TaqDNA聚合酶、质粒快速提取试剂盒、pMD18-T试剂盒,宝生物工程(大连)有限公司产品；Trizol 试剂、RNA 酶抑制剂、反转录酶 MLV、ddH2O等，北京全仕金生物技术有限公司产品；HRP标记的羊抗鸭酶标二抗，KPL公司产品；DAB底物显色液，北京天根生物科技有限公司产品；其他试剂均为分析纯。

1.1.3 仪器 普通PCR仪(Applied Biosystems 2720)，电泳仪(北京市六一仪器厂)，台式冷冻高速离心机(Beckman Coulter)，凝胶成像系统(BIORAD)。

1.2 方法

1.2.1 病毒的分离 采集发病雏鸭的肝脏，匀浆器中加入2倍～4倍体积生理盐水后进行研磨，研磨后的组织液反复冻融1次～2次后，12 000 r/min离心10 min。取上清，采用孔径为0.22 μm的一次性滤器过滤除菌，将除菌后的滤液经尿囊腔途径接种9日龄SPF鸡胚，每胚接种0.2 mL。病毒在鸡胚中盲传3代，鸡胚死亡时间稳定，一般维持在2 d～3 d死亡。无菌收集死亡鸡胚的尿囊液，分装于2 mL的离心管中，置-80℃保存备用[10]。

1.2.2 病毒的鉴定

1.2.2.1 引物的设计 根据GenBank 中公布的TMUV NS1的全基因序列(登录号：KJ740748.1)设计引物，引物序列为：NS1F：5′-CTTTGGGTTTGGAGTGTTG-3′；NS1R：5′-CTTGTATCCTGTCCTCGTGTT-3′。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，预期扩增片段大小为313 bp。

1.2.2.2 RT-PCR 采用Trizol法提取病毒RNA，然后进行反转录，获得病毒cDNA。反转录反应体系为20 μL，即上述总 RNA 5.0 μL，5×buffer 4.0 μL，20 μmol/L随机引物 1 μL，10 mmol/L dNTP 0.5 μL，40 U/μL RNA酶抑制剂0.5 μL，200 U/μL M-MLV 0.5 μL，ddH2O加至20 μL体积。离心混匀后进行反应。反转录的反应条件如下：30℃ 10 min，42℃ 60 min，70℃ 15 min，4℃ 10min。

以病毒的cDNA为模板，TMUV NS1F和NS1R为上、下游引物进行PCR扩增，PCR采用20 μL反应体系，反应体系如下：cDNA 2 μL，上游引物(20 mmol/L)1 μL，下游引物(20 mmol/L)1 μL，Mix 10 μL，DEPC水补足20 μL。反应程序如下：94℃预变性5 min；94℃ 30 sc，50℃ 30 s，72℃ 60 s，共30个循环；最后72℃ 10 min。

PCR扩增后的产物进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳。产物回收纯化后送上海生工生物工程技术服务有限公司进行核苷酸序列测定。

1.2.3 病毒全基因序列测定

1.2.3.1 引物的设计 根据GenBank中公布的TMUV的全基因序列(登录号：KJ740748.1)设计8对扩增全基因序列的引物，引物序列见表1，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

表1 扩增TMUV基因全长的引物序列

1.2.3.2 病毒全基因扩增 以上述扩增的病毒cDNA为模板，利用设计的8对引物进行TMUV全基因组的扩增，扩增产物回收纯化后分别与pMD18-T连接，然后克隆至DH5α中，将菌液PCR鉴定为阳性的克隆菌送至上海生工生物工程技术服务有限公司进行基因序列的测定。病毒全基因组3′末端序列和5′末端序列分别采用3′full race 试剂盒和5′full race试剂盒进行扩增。

1.2.4 序列分析 将测序后的病毒的全基因序列通过DNA Star软件进行序列拼接，获得病毒的全基因序列。将该病毒的全基因序列与GenBank中公布的16株分离自不同年份、不同时间和不同宿主的TMUV进行BLAST同源序列比对，用MEGA5、MegAlign等软件进行该病毒全基因遗传进化树的构建及核苷酸、氨基酸同源性分析(表2)。

2 结果

2.1 病毒的分离

病死鸭的肝脏处理液接种鸡胚后，鸡胚在72 h～96 h出现死亡，死亡鸡胚尿囊膜增厚，胚体全身出血，尤其是颈背部出血明显(图1)，胚体肝脏有的出现白色坏死点。

A.死亡鸡胚尿囊膜增厚;B.胚体全身出血，肝脏有白色坏死点

A.The thickening of allantoic membrane of dead chicken embryo;B.Aemorrhage and liver necrosis with white points in chicken embryo

图1病毒接种的鸡胚

Fig.1 The chicken embryo inoculated with the virus

2.2 病毒鉴定

将收集的死亡鸡胚尿囊液提取RNA，RT-PCR扩增后，10 g/L琼脂糖凝胶电泳进行检测，在大约313 bp左右的位置出现目的条带(图2)。将PCR产物回收后测序，结果与GenBank中公布的TMUV NS1序列同源性在99.0%以上，从而确定分离的病毒为TMUV，并将其命名为TMUV-SDSG株。

M.DNA 标准DL 2 000;1.鸡胚尿囊液；2.阴性对照

M.DNA Marker DL 2 000;1.Allantoic fluid of chicken embryo;2.Negative control

图2 RT-PCR鉴定结果

Fig.2 RT-PCR identification results

2.3 全基因组序列扩增

利用8对设计的病毒全基因组引物，进行RT-PCR扩增，10 g/L琼脂糖凝胶电泳进行检测，出现了8条目的片段(图3)。8条基因片段与T载体连接后进行序列测定，测序结果显示，8条目的片段与GenBank上公布的TMUV基因组序列相符。Race试剂盒扩增结果结果进行测序，与8条目的片段测序结果进行序列拼接，拼接后的基因序列全长为10 990 bp。

2.4 序列分析

病毒测序结果与GenBank上公布的不同时间分离自不同地区、不同宿主的TMUV全基因序列进行比对，MEGA5软件对这17条TMUV全基因序列的ORF进行分析，并绘制系统发育进化树(图4)。从进化树上可以看出,2010年—2016年间分离鉴定的TMUV可分为2个基因型，即基因Ⅰ和基因Ⅱ，基因Ⅰ型又形成2个分支，即亚型Ⅰa和亚型Ⅰb分支。从进化树上可以看出近年来在我国不同家禽中出现的TMUV主要集中分布在基因Ⅰ型分支上，而在基因Ⅰ型分支上，又集中分布在基因亚型Ⅰa型分支上。TMUV系统发育进化树的绘制，为生产实践中TMUV新型弱毒或灭活疫苗的研发提供重要的理论依据。本研究中分离这种TMUV属于基因Ⅰa，这与系统发育进化树的分析结果是一致的。

2.5 核苷酸同源性分析

对17条TMUV的全基因序列进行核苷酸同源性分析，结果显示，17条TMUV全基因序列核苷酸同源性在97.0%～99.8%之间(图5)，同源性很高。尤其是TMUV-SDAG株与基因Ⅰa分支中TMUV核苷酸同源性更高，均在99.0%以上。

M.DNA 标准DL 2 000;1～8.TMUV目的片段1～8；N.阴性对照

M.DNA Marker DL 2 000;1-8.1-8 objective fragments of TMUV;N.Negative control

图3 TMUV全基因RT-PCR扩增

Fig.3 The amplification of TMUV genome by RT-PCR

图4 TMUV系统发育进化树

图5 核苷酸同源性分析结果

3 讨论

1995年前后，我国河北省石家庄、邯郸等地饲养的康贝尔鸭出现腹泻、腿麻痹等症状，产蛋鸭生殖系统受损伤，温立斌等[14]最终分离并鉴定该病的病原属于黄病毒科，这是首次关于黄病毒感染鸭群的报道。国外最早报道TMUV感染家禽是2000年左右，从马来西亚发生肉鸡瘫痪的病例中分离到了一株TMUV，将其命名为实兆远病毒(Sitiawan virus，SV)，这是首次确定TMUV对禽类有致病性[15]。2010年，我国南方部分养鸭地区出现了TMUV感染鸭群的疫情[4-5]，很快波及到我国绝大多数养鸭地区，传播速度快，传播范围广，给养鸭业造成了巨大危害。

近年来，由于TMUV疫苗及防控措施在生产实践中的应用，水禽感染TMUV的几率有所降低，但与其他病原体混合感染的情况却不断增多。本研究从山东某发病肉鸭场分离到一株TMUV，并对其进行了鉴定。该病毒能在鸡胚和鸭胚中增殖，随着病毒在胚体中传代次数的增加，TMUV对鸡胚和鸭胚的致死能力趋于稳定，一般集中在3 d～4 d死亡，这与葛平萍等[16]的报道是一致的。

本研究对分离的病毒进行了全基因序列的测定，与GenBank中公布的多株不同时间分离自不同地点和宿主的TMUV ORF基因序列进行了核苷酸并对，通过MEGA5和DNA Star软件进行分析，并绘制了系统发育进化树。由于2010年以前分离鉴定的TMUV均没有在GenBank中上传其全基因序列，因此本研究中采用的TMUV全基因序列均为2010年后上传的。序列比对结果显示，从2010年—2016年出现的TMUV主要进化成了2个分支，其中分支1又进化出2个小分支。2010年—2016年中出现的TMUV主要属于分支Ⅰa，而分支Ⅱ和Ⅰb主要是2010年—2011年出现的TMUV分离株，之后出现的分离株主要是Ⅰa分支中，由此可见，Ⅰa分支可能是TMUV主要进化趋势，而分支Ⅱ和Ⅰb可能会随着病毒的不断变异进化而逐渐消失，这与李泽君等[17]对2010年—2013年中TMUV分离株ORF序列比对分析的结果是一致。本研究中分离鉴定的TMUV属于分支Ⅰa，这也与系统发育进化树中显示的结果是一致的。

通过对TMUV核苷酸同源性进行比对，结果显示，本研究分离鉴定的TMUV-SDSG分离株与GenBank公布的分离自2010年—2015年间的16株TMUV全基因序列同源性很高，而且来自不同分离时间、地区和宿主的TMUV核苷酸同源性也很高，均在97%以上。尤其是TMUV-SDSG分离株与进化树中基因Ⅰa型中TMUV核苷酸的同源性更高，均在99.0%以上。

本研究分离并鉴定了一株TMUV分离株，该病毒属于基因Ⅰa型，属于近年来TMUV流行主要基因型分支，且与GenBank中公布的其他TMUV核苷酸同源性很高。可见，TMUV-SDSG分离株是近年来TMUV流行的优势毒株，这为TMUV新型弱毒或灭活疫苗的筛选制备及该病毒分子流行病学的研究奠定了基础，并提供重要的依据。

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IsolationandGenomicSequenceAnalysisofDuckTembusuVirus

TI Jin-feng,LI Zhi-jie,LI Fang

(ShandongVocationalAnimalScienceandVeterinaryCollege,Shandong,Weifang,261061,China)

Cherry valley ducks at 21 days old got sick suddenly in Shandong Weifang and the ill ducks expressed neurological symptoms of paralysis,yellow-green or yellowish-white loose stool,and mortality about 5%.In order to determine the pathogen of sick ducks,firstly dead duck livers were collected and used to isolate and identify the pathogen through 9-11 day-old SPF chicken embryoes.Secondly the whole genome of virus was amplified by RT-PCR and sequenced.The phylogenetic tree was drawn by MEGA5 software and the nucleotide homology analysis was carried out by DNA Star software.The result showed that one Tembusu virus (TMUV) strain was isolated by SPF chicken embryo and was named TMUV-SDSG.The whole genome is 10 990 nt and encodes a polyprotein containing 3 426 amino acids.The analysis of phylogenetic tree showed that the TMUV-SDAG strain belongs to Ⅰa branch.The nucleotide homology analysis results showed that the nucleotide homology is as high as 97.0%-99.8% among the TMUV-SDSG strain and 16 TMUV isolates in GenBank.A TMUV strain was isolated successfully and analyzed which laid the foundation for screening and preparation of attenuated and inactivated vaccines and molecular epidemiological study.

duck Tembusu virus; nucleotide homology analysis; polyprotein

2017-02-17

山东省高等学校科技发展计划项目(J16LF58)；潍坊市科技发展计划项目(2013YD139，20121366)；山东省现代农业产业技术体系家禽创新团队建设项目(SDAIT-13-011-05)

提金凤(1977-)，女，山东莱州人，讲师，博士，主要从事家禽病毒性传染病研究。

S852.659.6;S858.32

:B

:1007-5038(2017)09-0128-06