乳酸菌素联合包膜丁酸钠对断奶仔猪腹泻的作用

刘东旭，李虹瑾，尹柏双，沙万里，付连军，李国江*

(1.吉林农业科技学院，吉林吉林 132101；2.吉林农业大学，吉林长春 130033； 3.吉林省预防兽医学重点实验室，吉林吉林 132101)

乳酸菌素联合包膜丁酸钠对断奶仔猪腹泻的作用

刘东旭1，3，李虹瑾2，3，尹柏双1，3，沙万里1，3，付连军1，3，李国江1，3*

(1.吉林农业科技学院，吉林吉林 132101；2.吉林农业大学，吉林长春 130033； 3.吉林省预防兽医学重点实验室，吉林吉林 132101)

为了探究乳酸菌素与包膜丁酸钠共添加对仔猪肠道菌群、生产性能、肠道结构及腹泻情况的影响,将90头体重7.53 kg±0.49 kg的28日龄断奶仔猪随机分为3组,A组为对照组，饲喂基础日粮；B组为乳酸菌素组，饲喂基础日粮+1.5 g/kg乳酸菌素；C组为共添加组，饲喂基础日粮+0.3 g/kg包膜丁酸钠&1.5 g/kg乳酸菌素，试验期28 d。试验期间，检测断奶仔猪肠道中菌群种类及数量的变化，同时监测并记录各试验组仔猪的日采食量、日增重及仔猪的腹泻情况。结果显示,试验组仔猪肠道有害菌的含量与对照组相比明显降低(P<0.05)；两个试验组的平均日增重显著高于对照组(P<0.05)，且呈现共添加组>乳酸菌素组>对照组的趋势；并且乳酸菌素组、共添组的料肉比均低于对照组且差异显著(P<0.05)。仔猪基础日粮中同时添加乳酸菌素和包膜丁酸钠后，腹泻率与腹泻指数分别降低42.72%与46.15%。观察试验后仔猪肠道形态，发现共添加组仔猪肠道形态更为完整，绒毛更长更粗壮。表明仔猪基础日粮中同时添加乳酸菌素与包膜丁酸钠，能够显著提高仔猪的生产性能，保护肠道益生菌的含量，维持肠道完整形态，并降低仔猪腹泻率。

仔猪；乳酸菌素；包膜丁酸钠；生产性能；腹泻

断奶是仔猪生长发育的重要过程[1]，由于从母乳喂养到采食饲料的饮食结构变化，断奶常常会对仔猪产生诸多影响。断奶初期仔猪很少釆食或不采食，一方面可能是由于胃肠道酸度降低，不能激活酶原，另一方面由于消化器官酶的合成和分泌受到影响所致[2-3]。同时断奶使得仔猪胃肠道内pH升高，饲料中的大肠埃希菌等细菌易通过胃而进入肠道且大量繁殖，大肠中的病原菌也容易逆行至小肠并大量增殖，乳酸杆菌、双歧杆菌等有益菌的增殖减少，微生物区系平衡失调，有益菌失去了在肠壁上的占位优势，过多的有害菌附着在肠壁上并释放毒素，穿透肠壁，引起一系列化学反应，损伤肠道，引起消化功能紊乱，免疫机能下降，易造成仔猪腹泻，营养吸收不足，生长受到抑制[4-5]。并且，现阶段猪场常用抗菌药物来预防和治疗仔猪腹泻。抗菌药物在杀灭肠道有害菌的同时，也杀灭了有益菌，导致肠道菌群失调，造成抗菌药物性腹泻[6]。为此，本试验在仔猪基础日粮中同时添加包膜丁酸钠及乳酸菌素，通过检测断奶仔猪肠道中菌群种类及数量的变化，并记录各试验组仔猪的日采食量、日增重及仔猪的肠道结构和腹泻情况。探索包膜丁酸钠和乳酸菌素对仔猪肠道菌群、生产性能、肠道结构及腹泻情况的影响。为研究防治断奶仔猪腹泻，提高仔猪生产性能，构建减少仔猪抗菌药物使用的健康养殖方法，提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

需氧菌培养基：伊红美蓝培养基(EMb)、SS琼脂(SS)、甘露醇氯化钠琼脂培养基、EC肉汤培养基(Ec)，厌氧菌培养基：双歧杆菌培养基、PMS培养基(PMs)、乳酸杆菌选择性培养基(LBs)、BDS培养基(BDs)，广东环凯微生物科技有限公司产品；多黏菌素B溶液、新生霉素，青岛尼赛欣合生物技术有限公司产品；生化鉴定瓶，广东环凯微生物科技有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 试验分组及日粮配方 将体重相近(7.53 kg±0.49 kg)的90头28日龄的长×大二元杂交断奶仔猪(已阉割)，随机分为3组：A、B、C组，每组3个重复，每个重复10头。A组为对照组，饲喂基础日粮；B组为乳酸菌素组，饲喂基础日粮+1.5 g/kg乳酸菌素；C组为共添加组，饲喂基础日粮+0.3 g/kg包膜丁酸钠和1.5 g/kg乳酸菌素。试验期28 d。基础日粮配方见表1。

表1 基础日粮组成及营养水平

1.2.2 饲养管理 试验仔猪在吉林农业科技学院畜牧场饲养，饲养过程严格按照猪场管理规范进行，并按正常程序进行免疫预防接种和驱虫。

1.2.3 细菌分离鉴定 试验最后1天，无菌手术收集各组仔猪肠道内容物1 g，并溶于1 mL PBS中，取50 μL肠道内容物进行10倍梯度稀释至10-7。根据各培养基说明书制备相应的选择培养基。将稀释好的细菌涂布至选择培养基中，每个梯度做3个重复。按选择培养基及接种对象不同，作需氧或厌氧培养，以分离培养出肠道中相应菌种(表2)。各肠道菌群数量采用平板菌落计数方法，将计数结果(CFU/g)取对数记录。1 g样品中细菌总数的计算公式为：细菌数=记录数×稀释倍数×1 000/50。对选择培养基中的细菌进行革兰染色，并对分离出来的细菌进行传代培养，并进行细菌生化鉴定。

表2 菌属的培养方法

1.2.4 生长指标及腹泻率的测定 每天记录并计算各组的采食量、日均采食量，试验结束后计算料肉比。每天早晨8:00，称量空腹仔猪重量并记录，根据每日体重计算平均日增重。同时观察仔猪粪便形态、颜色，记录腹泻头数及腹泻情况，计算腹泻率。腹泻率(%)=总腹泻次数/(总头数×试验天数)×100%；腹泻指数=粪便评分之和/供试猪总头数，评分标准见表3，该指数越高，表示腹泻越严重。

1.2.5 肠组织切片制作 试验结束后，各组随机无菌手术截取5头仔猪肠组织1 cm～2 cm，放置于100 g/L的甲醛溶液中固定12 h～14 h后,持续水洗24 h。组织样本经梯度酒精脱水后，二甲苯中透明20 min。将透明的肠组织样本浸蜡、包埋、冷冻后，对仔猪肠道组织进行切片。应用苏木精及伊红溶液对组织切片进行染色[7]。光学显微镜下，记录组织形态并拍摄组织照片。

表3 腹泻评分标准

1.2.6 统计学分析 使用Graph Pad Prism软件对试验数据进行统计分析，并通过t检验确定试验数据是否具有统计意义。P<0.05为差异显著。

2 结果

2.1 仔猪肠道菌群的分离及鉴定

对试验后，无菌手术采集的肠道内容物梯度稀释液选择培养结果显示，选择培养基筛选出的主要肠道细菌有乳杆菌、双歧杆菌、葡萄球菌、大肠埃希菌、肠球菌等(图1)。各组取样获得的肠道内容物经处理后，对仔猪肠道中细菌进行计数，结果显示，仔猪基础日粮中同时添加乳酸菌素及包膜丁酸钠能够明显上调肠道中有益菌——双歧杆菌的数量(P<0.05)，降低肠道中有害菌——大肠埃希菌、肠球菌及金黄色葡萄球菌的数量(P<0.05)(表4)。

A.乳杆菌；B.双歧杆菌；C.大肠埃希菌；D.肠球菌；E.金黄色葡萄球菌

A.Lactobacillus；B.Bifidobacterium；C.Escherichiacoli；D.Enterococcus；E.Staphylococcusaureus

图1断奶仔猪肠道分离菌革兰染色结果

Fig.1 Gram staining results of bacteria isolated from intestine of weaned piglets

表4 乳酸菌素联合包膜丁酸钠对仔猪肠道主要菌群的影响

注：角标相同字母表示差异不显著(P>0.05)；不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。

Note：Values with same letters indicate no significant difference in the same column(P>0.05),and with different small letters mean significant difference(P<0.05),and with different capital letters mean extremely significant difference(P<0.01).

2.2 乳酸菌素及包膜丁酸钠对仔猪生产性能影响

对试验用断奶仔猪进行生产性能指标监测，并计算仔猪平均日增重、平均日采食量及料肉比，结果如表5所示。从表5可知，试验开始前，仔猪的初始体重没有显著差异(P>0.05)，而随着试验结束，统计分析仔猪生产性能发现，2个组试验组的平均日增重显著高于对照组，且呈现共添加组>乳酸菌素组>对照组的趋势。与对照组相比，乳酸菌素组和共添加组平均日增重分别提高4.89%及8.99%，差异显著(P<0.05)。计算各组料肉比，对照组的料肉比为1.81，乳酸菌素组、共添加组的料肉比分别为1.79和1.73。对比对照组，其料肉比分别降低了1.10%和4.42%，差异显著(P<0.05)。

表5 乳酸菌素联合包膜丁酸钠对仔猪生产性能的影响

注：角标相同字母表示差异不显著(P>0.05)；不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。

Note：Values with same letters indicate no significant difference in the same rown(P>0.05),and with different small letters mean significant difference(P<0.05),and with different capital letters mean extremely significant difference(P<0.01).

2.3 乳酸菌素联合包膜丁酸钠对仔猪腹泻率及腹泻指数的影响

每天观察并记录各试验组断奶仔猪腹泻情况，计算各组断奶仔猪腹泻率与腹泻指数，所得结果如表6所示。

根据表6分析可知，仔猪基础日粮中同时添加乳酸菌素与包膜丁酸钠后，腹泻率与对照组相比明显降低(P<0.05)。对比各组腹泻指数及腹泻率，乳酸菌素与包膜丁酸钠共添加组对比对照组差异极显著(P<0.01)，腹泻率降低42.72%，腹泻指数降低46.15%。

2.4 乳酸菌素联合包膜丁酸钠对仔猪肠道结构的影响

试验结束后，各组断奶仔猪随机选取5头，无菌手术法截取肠组织，进行肠道组织切片及HE染色，显微镜下观察。对比对照组和乳酸菌素组，共添加组仔猪的小肠绒毛结构更为完整、健康，绒毛更长更粗壮(图2)。

表6 乳酸菌素联合包膜丁酸钠对断奶仔猪腹泻率及腹泻指数的影响

注：角标相同字母表示差异不显著(P>0.05)；不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。

Note：Values with same letters indicate no significant difference in the same column(P>0.05),and with different small letters mean significant difference(P<0.05),and with different capital letters mean extremely significant difference(P<0.01).

A.对照组;B.乳酸菌素组;C.共添加组

A.Control group;B.Lactic acid bacteria group;C.Co-addition group

图2各组仔猪肠道绒毛组织切片结果(HE,400×)

Fig.2 The intestinal villus tissue results of different groups(HE,400×)

3 讨论

3.1 乳酸菌素联合包膜丁酸钠对断奶仔猪肠道菌群的影响

乳酸菌素和丁酸均会降低肠道内pH[8]。理论情况下，在酸性环境中，作为有益菌的乳杆菌和双歧杆菌的生长会胜过有害菌大肠埃希菌。但是本试验结果中显示，在仔猪基础日粮中单独添加乳酸菌素后，虽然降低仔猪肠道中有害菌大肠埃希菌的含量，但是也同时降低肠道中乳杆菌的含量，这可能与乳酸菌素的特性有关，对于亲缘关系较近的种属具有抗菌生物活性。饲料中的乳酸菌素抑制了乳杆菌的生长。同样的原因，使得在仔猪饲料中同时添加乳酸菌素和包膜丁酸钠后，即使包膜丁酸钠可以增加有益菌群(乳杆菌)的含量，共添加组仔猪肠道中乳杆菌的含量只是与对照组相近。

3.2 乳酸菌素联合包膜丁酸钠对断奶仔猪腹泻的影响

丁酸作为短链脂肪酸中的重要代表，是结肠细胞的重要营养物质，能为肠道上皮细胞提供能量，在调节胃肠机能、肠道微生态平衡、电解质平衡和肠道pH有着重要作用[9-10]。而乳酸菌素也恰恰在肠道菌群调节上也有重要作用。对乳酸菌素进行抑菌试验研究表明，乳酸菌素对如大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、福氏志贺菌、铜绿假单胞菌、单核增生李斯特菌等动物肠道的病原菌都有很好地抑制作用。因此，本试验在仔猪基础日粮中同时添加乳酸菌素和包膜丁酸钠后，仔猪肠道中有害菌——大肠埃希菌、肠球菌及金黄色葡萄球菌的含量显著降低，并增加有益菌——双岐杆菌的含量，维持乳杆菌水平，促进仔猪健康肠道微生态环境的建立。对比本试验各组腹泻指数及腹泻率发现，与对照组相比，在仔猪基础日粮中添加乳酸菌素和包膜丁酸钠后可降低腹泻率和腹泻指数，且共添加组降低效果优于单独添加乳酸菌素组。表明乳酸菌素与包膜丁酸钠共添加在降低仔猪腹泻指数上有良好效果，且二者之间有协同作用，共同添加效果比单一添加乳酸菌素效果大幅提升。

3.3 乳酸菌素联合包膜丁酸钠对断奶仔猪肠道结构及生长性能的影响

生产性能是反映仔猪营养状态最直接的指标。在断奶仔猪饲料中分别添加1.5 g/kg的乳酸菌素、0.3 g/kg包膜丁酸钠1.5 g/kg乳酸菌素后，与对照组相比，断奶仔猪的日增重及料肉比的降低，呈现共添加组>乳酸菌素组>对照组的趋势。提示乳酸菌素及包膜丁酸钠共同作用能够增加仔猪的生长性能。这可能与乳酸菌素及包膜丁酸钠的独特作用机制有关。有文献指出，乳酸菌素能够促进胃液的分泌，增强胃肠的消化蠕动，使食物更好地消化吸收，而包膜丁酸钠独特的乳臭味，具有强烈的诱食性[11]，因此，二者共同作用能够大幅提升仔猪对饲料的采食量，并且包膜丁酸钠能直接为肠上皮细胞提供能量，以诱导促进肠上皮细胞的分化增殖和成熟，而小肠黏膜上皮细胞是执行消化吸收功能的最主要细胞。因此，在仔猪饲料中同时添加乳酸菌素和包膜丁酸钠，能够促进仔猪对饲料的转化率，提高仔猪的生产性能。同时，包膜丁酸钠也能促进肠黏膜修复，抑制肠道炎症反应，能够帮助维持肠道结构和形态的完整，促进肠绒毛及隐窝组织的发育。因此，在本次试验中，乳酸菌素和包膜丁酸钠共添加组的小肠绒毛结构更为完整，绒毛长而粗壮，绒毛呈圆柱状。而对照组和乳酸菌素组中，肠组织无明显差异，小肠绒毛均呈平舌状，绒毛稀疏。说明包膜丁酸钠能够帮助仔猪维持肠道完整形态，促进小肠绒毛发育，从而维持肠道健康，而乳酸菌素对仔猪肠道结构无明显影响。

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EffectofLacticacidbacteriaCombinedwithCoatedSodiumButyrateonDiarrheaofWeanedPiglets

LIU Dong-xu1，3, LI Hong-jin2，3, YIN Bai-shuang1，3, SHA Wan-li1，3, FU Lian-jun1，3, LI Guo-jiang1，3

(1.JilinAgriculturalScienceandTechnologyUniversity,Jilin,Jilin,132101,China;2.JilinAgriculturalUniversity,Changchun,Jilin,130033,China；3.KeyLabofPreventiveVeterinaryMedicineinJilinProvince,Jilin,Jilin,132101,China)

In order to explore the effects of lactic acid bacteria,and coated sodium butyrate on intestinal flora,production performance,intestinal structure and diarrhea of piglets,90 weaned piglets with similar weight were randomly divided into 3 groups:group A control group,the weaned piglets were fed with basal diet;B lactic acid bacteria group,the weaned piglets were fed with basal diet +1.5 g/kg lactic acid bacteria;C co-addition group,the weaned piglets were fed with basal diet +1.5 g/kg lactic acid bacteria & 0.3 g/kg coated sodium butyrate.The experimental period was 28 days.During the experiment,the changes of the type and quantity of the intestinal flora in the weaned piglets were detected,and the daily feed intake,daily gain and diarrhea were recorded.The results showed that the contents of harmful bacteria in intestinal tract of experimental group were significantly lower than that of control group (P<0.05).The average daily gains of the two experimental groups ware significantly higher than that of the control group (P<0.05),and showed a trend of co-addition group> lactic acid bacteria group>control group;and the feed/meat ratio of lactic acid bacteria group and co-additive group was lower than that of control group (P<0.05).Diarrhea rate and diarrhea index decreased by 42.72% and 46.15% respectively after adding both lactic acid bacteria and coated sodium butyrate in piglet diets.The intestine morphology of the piglets was observed and found that the intestine morphology of piglets was more complete and the villi were longer and thicker.The results showed that lactic acid bacteria and coated sodium butyrate could significantly improve the production performance of piglets,protect the content of probiotics,maintain intestine integrity and reduce the diarrhea rate of piglets.

piglets;lactic acid bacteria;coated sodium butyrate;production performance;piglet diarrhea

2017-02-15

吉林省教育厅科学技术研究项目(2015380)；吉林省科技发展计划项目(20150623004TC)

刘东旭(1985-)，女，吉林吉林人，讲师，博士，主要从事预防兽医学研究。*

S858.28;859.794

:A

:1007-5038(2017)09-0084-06