亲水作用色谱-高分辨质谱测定生鲜牛乳中7种氨基糖苷类药物残留

王帅兵，曲 斌，耿士伟，陆桂萍，蒋天梅，陈 蓉

(1.江苏农牧科技职业学院，江苏泰州 225300；2.江苏省畜产品质量检验测试中心，江苏南京 210036；3.中国药科大学理学院，江苏南京 211198)

亲水作用色谱-高分辨质谱测定生鲜牛乳中7种氨基糖苷类药物残留

王帅兵1，曲 斌2*，耿士伟2，陆桂萍2，蒋天梅2，陈 蓉3

(1.江苏农牧科技职业学院，江苏泰州 225300；2.江苏省畜产品质量检验测试中心，江苏南京 210036；3.中国药科大学理学院，江苏南京 211198)

建立了生鲜牛乳中链霉素、双氢链霉素、庆大霉素、妥布霉素、卡那霉素、阿米卡星和安普霉素共7种氨基糖苷类抗生素残留的超高效液相色谱-串联质谱检测方法。样品经100 mL/L三氯乙酸-乙腈提取和WCX固相萃取柱净化后，采用亲水作用色谱分离，四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱检测。对样品前处理条件、液相色谱流动相及质谱条件进行了优化。结果表明，7种氨基糖苷类抗生素在20 μg/L～500 μg/L范围内线性关系良好，生鲜牛乳中的加标回收率为88.7%～111.2%，相对标准偏差为6.3%～13.1%，该方法灵敏、准确，可用于生鲜牛乳中多种氨基糖苷类抗生素残留的同时检测。

氨基糖苷类；亲水作用色谱-高分辨质谱；生鲜牛乳

氨基糖苷类抗生素(aminoglycosides，AGs)是一类由1个或多个氨基糖分子与氨基环醇通过氧桥连接而成的苷类抗生素，极性大，呈碱性。AGs药物对多种革兰阳性菌和革兰阴性菌均有较强杀菌作用，在养殖过程中被广泛用于预防和治疗奶牛乳房炎[1]。然而，不合理用药或不遵守休药期规定滥用药物常导致牛、羊等生鲜乳中出现AGs药物残留，长期饮用含AGs药物残留的乳制品可能对消费者产生耳毒性和肾毒性[2]。此外，AGs药物残留引起细菌产生耐药性的问题也不容忽视[3]。因此，国内外对生鲜乳及其他动物源性食品中AGs药物残留问题非常重视，欧盟、美国对动物性食品中AGs药物残留均有明确规定[4]，我国农业部规定生鲜乳中AGs药物的最高残留限量(MRL)为100 μg/kg～500 μg/kg[5]。

目前，用于测定生鲜乳中AGs药物残留的方法主要有微生物分析法、免疫分析法和仪器分析法[2]，其中液相色谱-串联质谱法因其定量准确、灵敏度高成为检测AGs药物残留的确证方法[6]。实际测定中因AGs药物极性大，难以在反相色谱柱上保留，故当前多通过向流动相中加入离子对试剂以增强色谱保留[7-8]。然而离子对试剂容易污染色谱柱，对pH也较敏感，影响试验结果的重复性和重现性。选用亲水作用色谱柱(hydrophilic interaction chromatography,HILIC)则不同，在简单的流动相组成条件下即可大大改善极性化合物的色谱行为，还可提高电喷雾离子化质谱的灵敏度，十分适用于AGs药物分析。本试验根据AGs药物的理化特点，通过改进样品前处理方法，选用HILIC色谱柱，优化测定条件，建立一种高效、灵敏的AGs药物多残留检测方法，可同时测定生鲜牛乳中7种AGs药物残留，为有效监控该类药物残留提供基础手段。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器与设备 MS3基本型漩涡混匀器、KS501圆周振荡摇床，德国IKA公司产品；Sigwa2K15高速冷冻离心机，Sigma公司产品；Oasis WCX固相萃取小柱(60mg/3mL)，Waters公司产品；N-EVAP 112型氮吹仪，美国Organomation 公司产品；Q Exactive Orbitrap LCMSMS四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱，美国Thermo公司产品，配置电喷雾离子源；UltiMate 3000型超高效液相色谱仪，美国Thermo公司产品，配自动进样器和柱温箱。

1.1.2 标准品与试剂 链霉素、双氢链霉素、 庆大霉素、 妥布霉素、卡那霉素、阿米卡星和安普霉素7种标准品，德国Dr.Ehrenstorfer公司产品，含量为98%～99%；三氯乙酸、乙二胺四乙酸二钠、氨水为分析纯；乙腈、甲醇、甲酸为色谱纯；试验用水为超纯水。

1.2 方法

1.2.1 标准储备液的配制 准确称取链霉素、双氢链霉素、庆大霉素、妥布霉素、卡那霉素、安普霉素和阿米卡星标准品各10 mg，用水溶解并定容至100 mL，混匀，即为100 mg/L的标准储备液，4℃避光保存于塑料瓶中，备用。

准确移取上述标准储备液0.5 mL，置于50 mL容量瓶中，用水稀释定容，配制成1 μg/mL的中间标准工作液，备用。

1.2.2 基质匹配标准工作溶液的配制 精密称取空白生鲜牛乳各2.00 g，置于50 mL聚丙烯塑料管中，分别加入中间标准工作液(1 μg/mL)0.04、0.1、0.2、0.4、1.00 mL，制成浓度相当于20、50、100、200、500 μg/L的基质匹配标准工作溶液。

1.2.3 样品前处理 准确称取2.00 g匀质的生鲜牛乳样品，置50 mL聚丙烯塑料离心管中，加入100 mL/L三氯乙酸(含0.4 mmol/L EDTANa2)8 mL和乙腈2 mL，旋涡振荡，10 000 r/min离心5 min，上清液转移至另一离心管中，加入500 mL/L氨水调节pH至8.5±0.5，再加正己烷2 mL振荡，离心，下层水相转移至另一塑料离心管中，备用。

取WCX固相萃取小柱，依次用甲醇3 mL、水3 mL活化，将上述备用溶液上样过柱，依次用1 mL/L氨水3 mL 、甲醇3 mL淋洗，用250 mL/L甲酸甲醇(V/V)6 mL洗脱，收集洗脱液，37℃氮气吹干。加入1 mL乙腈-100 mmol/L甲酸铵(体积比为90∶10)溶液，充分涡旋使复溶，过0.22 μm微孔滤膜，取滤液上机待测。

1.2.4 测定条件 液相色谱条件：色谱柱为ACQUITY CORTECS HILIC (2.1 mm×100 mm×1.7 μm,Waters公司)；柱温25℃，进样量25 μL。流动相A为200 mmol/L甲酸铵水溶液(用甲酸调pH2.5)，B为含100 mmol/L甲酸铵的乙腈∶水(70∶30，V/V)溶液(用甲酸调pH4.0)，梯度洗脱程序如表1。

表1 液相色谱梯度洗脱程序

质谱条件：电喷雾离子源(ESI)，正离子扫描，雾化气压力为60.00 Psi(413.4 kPa)，离子喷雾电压为4.0 kV，气帘气压力为25.00 Psi(172.2 kPa)，离子化温度为450℃，检测方式为多反应监测(MRM)扫描模式。优化后确定的离子对和相关质谱参数如表2。

表2 7种氨基糖苷类抗生素质谱分析参数

2 结果

2.1 方法的选择性

通过改善样品前处理方法、优化色谱条件和质谱条件，选择丰度较强的二级碎片离子作为定量离子，确定7种药物的特征离子对，同时检测牛奶中7种AGs药物，所有目标药物全部出峰且峰形对称，7种AGs的MRM色谱图如图1。需说明的是，庆大霉素有两个组分庆大霉素C1和C1a，两组分有明显不同的特征离子对并先后出峰。

2.2 方法的线性关系与定量限

将配制的浓度相当于20、50、100、200、500 μg/L的基质匹配标准工作溶液，进行预处理后进样测定。将各被测药物的色谱峰面积与理论浓度采用一元二次回归方程拟合，得到7种AGs药物的线性方程、相关系数及线性范围见表3，回归曲线见图2。所有药物在20 μg/L～500 μg/L的范围内线性良好，相关系数均在0.99以上。被测药物的定量限(LOQ)根据其响应值大于等于基线响应值的10倍(信噪比S/N≥10且准确度和精密度(RSD)小于20%来确定。当牛奶中7种AGs药物的添加水平在20 μg/L时，其信噪比均大于10，表明本方法的LOQ可达20 μg/L。

A.链霉素；B.双氢链霉素；C.庆大霉素C1；D.庆大霉素C1a； E.妥布霉素；F.卡那霉素；G.阿米卡星；H.安普霉素

表3 7种氨基糖苷类药物的线性范围和线性方程

2.3 方法的回收率和精密度

精密称取空白生鲜牛乳2.00 g，分别添加低(50 μg/L)、中(100 μg/L)、高(200 μg/L)3个水平的7种氨基糖苷类药物，按所建立的方法进行样品处理和测定，每个添加浓度做5个平行。平均回收率和相对标准偏差(RSD)(表4)。

a.链霉素；b.双氢链霉素；c.庆大霉素C1；d.庆大霉素C1a； e.妥布霉素；f.卡那霉素；g.阿米卡星；h.安普霉素

2.4 实际样品检测

采用所建立的方法对实验室留样的50个生鲜牛乳样品进行检测，未检出氨基糖苷类药物残留。

3 讨论

3.1 样品前处理条件的优化

3.1.1 提取溶液的选择 因生鲜牛乳中含大量蛋白质及其他内源性化合物，干扰目标药物的测定。因此，需沉淀蛋白质，将药物从基质中分离出来。依据AGs药物极性大，易溶于水的特性，可选用KHPO4缓冲液[9]、三氯醋酸( trichloroacetic acid,TCA)溶液[10]或乙酸铵缓冲液[11]等提取。因TCA溶液兼具提取和去蛋白效果，所以，本试验中采用TCA溶液作为提取试剂，并比较了了50、100、200 mL/L 3种不同浓度TCA的提取效果。结果表明，随着酸浓度提高，去蛋白效果也越好，但200 mL/L TCA提取不能使全部药物出峰，可能因酸浓度过高产生离子抑制作用。因此，选择100 mL/L TCA为主要提取溶液，通过试验比较发现，向100 mL/L TCA中加入少量乙腈可以提高去蛋白效果。

3.1.2 固相萃取条件优化 AGs药物为强极性化合物，在弱碱性环境下以阳离子态存在。故本试验中选择弱阳离子交换小柱(WCX小柱)来净化、富集样品。按照WCX小柱提供商的方法依次用3 mL甲醇、3 mL水活化，上样后用50 mL/L氨水、甲醇各3 mL依次淋洗，最后用3 mL 50 mL/L甲酸甲醇洗脱，并不能将7种药物全部洗脱下来。因此，通过改变淋洗液氨水的浓度、提高洗脱液中甲酸含量并增大洗脱液体积进行选择优化，结果发现,采用1 mL/L氨水淋洗、250 mL/L甲酸甲醇6 mL洗脱可将7种药物全部洗脱，且回收率高。同时比较了同一浓度甲酸甲醇与甲酸乙腈的洗脱效果，结果发现，甲酸甲醇比甲酸乙腈可获得更高回收率，其原因在于甲醇的极性高于乙腈，故更易将极性大的AGs药物洗脱下来。

表4 7种氨基糖苷类药物的平均回收率及相对标准偏差

样品溶液的pH影响AGs药物的存在形式及其在固相萃取(SPE)小柱上的保留及分离，进而影响回收率。试验中考察了样品在pH 7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0和10.5的回收率。结果表明，样品溶液pH为8.0～8.5时，所有药物的回收率最高。

3.2 色谱条件的优化

3.2.1 进样溶液组成 试验中先后以水、含100 mmol/L甲酸铵的700 mL/L乙腈水(7∶3,V/V)溶液、含100 mmol/L甲酸铵的900 mL/L乙腈水(3∶1,V/V)溶液作为进样溶液进行比较，结果表明以水为进样溶液7种AGs药物在设定时间内均未出峰，究其原因是样品在HILIC色谱柱上的分离不是在亲水环境下进行，样品中含水过多，被测药物在固定相上的分配减弱，保留降低。100 mmol/L甲酸铵的乙腈水(V/V)溶液可使7种药物全部出峰，但采用700 mL/L乙腈溶解样品时色谱峰有一定拖尾现象，当进样溶液中乙腈含量提高到900 mL/L时可明显改善峰形，可能是进样液中有机相增强了药物在固定相上的分配，从而提高了柱效。

3.2.2 流动相组成与pH 采用HILIC色谱柱分离时，流动相中有机相比例增加，被测药物保留时间长。梯度洗脱时起始阶段使用高比例有机相，可延长AGs药在色谱柱上的保留，有利于基质中杂质与药物的分离，后期逐渐提高水相比例，促进AGs药依次出峰。试验中比较了甲醇-水、乙腈-水、流动相中添加甲酸铵对药物在色谱柱的分离效果，发现以乙腈为有机相时各目标物的响应值和峰形均优于甲醇，添加甲酸铵后可明显提高药物分离度，缩短保留时间。值得注意的是，因HILIC柱的固定相是亲水的，工作时部分流动相是作为固定相的一部分来起作用的，因此，流动相中必须始终保持一定量的水。由于HILIC色谱柱在pH1.5～8作用稳定，AGs在碱性条件下带正电荷，故流动相中以甲酸铵为缓冲盐时应使pH2～5。因此最终确定200 mmol/L甲酸铵水溶液(用甲酸调pH2.5)、含100 mmol/L甲酸铵的乙腈∶水(70∶30，V/V)溶液(用甲酸调pH4.0)作为流动相。

3.3 质谱条件的优化

氨基糖苷类抗生素化学结构中含羟基及胺基，呈碱性，在质谱上有很强的正离子响应，故选择正离子模式扫描。将100 μg/L单标溶液进样分析，进行母离子扫描，7种AGs药物的一级质谱图中均出现丰度较高的准分子离子峰[M+H]+，故选择准分子离子峰作为母离子。分别对7种AGs药物的母离子进行轰击碎裂，选择丰度较强的二级碎片离子作为定量离子，确定7种药物的特征离子对。最后优化ESI源的碰撞电压、离子化温度、气帘气等参数，确定最佳质谱条件。

本研究建立了采用亲水作用色谱-高分辨质谱法同时检测生鲜牛乳中链霉素、双氢链霉素、庆大霉素、妥布霉素、卡那霉素、阿米卡星和安普霉素共7种AGs药物多残留测定方法。该方法通过改善前处理方法，选用HILIC色谱柱提高AGs药物的分离效果，定量准确，LOQ低于国家对AGs规定的 MRL 100 μg/L，适用于实际样品的检测，可作为生鲜牛乳中AGs药物残留监测的手段。

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DeterminationofSevenAminoglycosidesResiduesinRawCowMilkbyHILIC-HRMS

WANG Shuai-bing1,QU Bin2,GENG Shi-wei2,LU Gui-ping2,JIANG Tian-mei2,CHEN Rong3

(1.JiangsuAgri-animalHusbandryVocationalCollege,Taizhou,Jiangsu,225300,China; 2.AnimalProductsQualityInspectionandTestCenterofJiangsuProvince,Nanjing,Jiangsu,210036,China; 3.CollegeofScience,ChinaPharmaceuticalUniversity,Nanjing,Jiangsu,211198,China)

A ultra-high performance liquid chromatography-transdem mass spectrometry method was developed for the simultaneous determination of seven aminoglycosides residues including streptomycin,dihydrostrepmycin,gentamycin,tobramycin,kanamycin,amkacin and apramycin in raw cow milk.The samples were extracted with 100 mL/L trichloroacetic acid aqueous solution and acetonitrile,then the extracts were purified by a WCX cartridge.The seven aminoglycosides residues were seperated by hydrophilic interaction liquid chromatography and detected by high resolution mass spectrometry.The pretreatment condition of the sample,the HPLC condition and the MS operation parameters were optimized.The results showed that the lineareties of the seven aminlglycoside residues in 20 μg/L-500 μg/L had the correlation coefficient between 0.990 0-0.997 5.The recoveries raged from 88.7%-111.2% with the relative standard deviations of 6.3%-13.1%.The proposed method was successfully applied to the determination of the mass concentrations of the analytes in related samples,which provided a sensitive and quantitative method for the quality control of raw milk.This method is effective for the safety monitoring of aminoglycosides residues in raw milk.

aminoglycosides; hydrophilic interaction liquid chromatography-high resolution mass spectrometry (HILIC-HRMS); raw cow milk

2016-10-11

王帅兵(1979-)，女，湖北黄梅人，讲师，硕士，主要从事动物药品分析与应用相关的教学与科研工作。*

S859.84

:A

:1007-5038(2017)09-0067-06