荷人卵巢癌小鼠异种移植模型的建立及其生物学特性

李若玢，陈均源， 欧阳媛，高绿芬，王晓玉

荷人卵巢癌小鼠异种移植模型的建立及其生物学特性

李若玢，陈均源， 欧阳媛，高绿芬，王晓玉

卵巢肿瘤；Matrigel；NOD/SCID小鼠；裸鼠；动物模型

卵巢癌病死率位居妇科三大恶性肿瘤之首，病理同型癌症患者的基因层面差异导致其对传统放、化疗敏感性各异[1]。患者源性异种移植(patient-derived xenograft, PDX)小鼠模型中除了癌细胞以外，还包括人体免疫、纤维、脉管细胞等间质成分，与传统细胞株悬液构建的小鼠模型相比，保留了原肿瘤部分免疫生长微环境，为卵巢癌耐药机制研究、新药开发及治疗方案筛选提供了具有预测价值的个性化抗癌药物疗效检测平台[2]。然而目前PDX建模方法存在成瘤率低、周期长、成本高、难以扩大规模等不足，本实验针对其不足进行改进，现介绍如下。

1 材料与方法

1.1 人卵巢癌原代及传代异种移植模型建立 BALB c(nu-nu)雌性裸小鼠58只，NOD/SCID雌性小鼠6只，鼠龄4～8周，购自北京华阜康生物公司，合格证号：SCXK(京)2014-0004，饲养于暨南大学实验动物中心无特定病原体环境下。术中取患者新鲜卵巢癌组织(病理诊断为卵巢黏液性囊腺癌高分化型)置于4 ℃ RPMI 1640培养液(美国Gibco公司)，于净化工作台上去除微小血管及坏死组织，无菌生理盐水反复冲洗后剪切成大小2 mm×2 mm×2 mm组织块，冰浴下1 ∶1与Matrigel(美国BD公司)混合备用。小鼠常规消毒，取备用组织块于套管针头内，组织镊提起右背部表皮，于皮肤张力最大处穿刺进入小鼠右腋下，推动实体针，植入皮下，标本离体后须在1 h内完成接种，此为原代荷人卵巢癌小鼠模型(下称PDX1)，其中NOD/SCID小鼠6只(下称PDX1-1)，裸小鼠8只(下称PDX1-2)。待初种瘤体直径达1 cm后，选择表面血供好、无破溃，质地稍硬荷瘤小鼠处死，取瘤体外围发亮部分组织，按上述移植方法接种于25只裸小鼠，建立第2代荷人卵巢癌小鼠模型(下称PDX2)。再次成瘤后重复上述步骤，建立第3代荷人卵巢癌小鼠模型(下称PDX3)。

1.2 移植后动物及瘤体生长情况观察 每日进行小鼠全身状况、活动情况观察及瘤体测量，按公式V=(D×d2)/2计算瘤体体积(D为肿瘤表面最长径，d为肿瘤表面最短径)，绘制瘤体生长变化曲线。处死小鼠后肉眼观察移植瘤的形态、质地、活动度、播散范围及转移情况。瘤体组织固定于10%中性福尔马林中，石蜡包埋、切片、HE染色，镜下观察。

1.3 统计学处理 采用SPSS 13.0软件进行统计学分析，采用t检验，计量资料采用或百分率表示，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 人卵巢癌移植瘤生长情况 各代卵巢癌小鼠成瘤率分别是PDX1-1 83%(5/6)、PDX1-2 0(0/8)、PDX2 100%(25/25)、PDX3 100%(25/25)。根据瘤体生长情况绘制生长变化曲线图(图1)，提示瘤体于5～6周左右进入指数生长期，8周左右基本成瘤。原代NOD/SCID小鼠较裸小鼠成瘤率高，生长速度更快，并伴发头面部、腹腔脏器转移灶(图2A)；传代裸小鼠成瘤及生长速度更快，但均无转移情况(图2B)；以上瘤体直径接近1.5 cm即出现表面破溃、坏死，直径超过3 cm荷瘤鼠出现行动不便、食欲减退、消瘦等恶病质表现。

图1 实体瘤生长曲线

2.2 移植瘤大体形态 切除的瘤体外观呈球形，质稍硬，包膜多完整，表面可见血管纹理，剖开后呈乳白色，囊实性，部分瘤体内含黏液，较大瘤体中央可见液化性坏死区(图3)。

2.3 人卵巢癌及其各代模型瘤组织镜检 PDX1移植瘤镜下可见腺腔样结构，腺体大小不一，形态不规则，间质较少，上皮细胞明显异型性，核仁明显，病理性核分裂象易见，与人卵巢癌原有排列结构及瘤细胞的异型性特征基本一致。随着传代次数增加，分化变低，腺样结构逐渐消失，上皮细胞分化差，核异型性明显(图4)。

②A②B③④A④B④C④D

图2 荷卵巢癌小鼠：A.NOD/SCID小鼠；B.裸小鼠 图3 实体瘤大体形态 图4 人卵巢癌及其各代模型瘤组织HE染色：A.人卵巢癌；B.PDX1-1；C.PDX2；D.PDX3

3 讨论

建立PDX模型首先要解决宿主抗人组织的免疫排斥问题，国外常用T、B、NK三系免疫细胞缺陷的NOD/SCID小鼠建模，成瘤率高，建模周期短，但成本昂贵[3]。国内多采用T细胞功能缺陷的裸小鼠建模，虽然大大降低了成本，但成瘤率及瘤体生长速率明显降低[4]。Mullen等[5]采用Matrigel与5种卵巢癌细胞株混合后移植到小鼠体内，成瘤率可提高至90%以上。Matrigel是从EHS小鼠肉瘤中提取的细胞外基质蛋白，富含各种促进细胞增殖及分化的生长因子及蛋白，4 ℃呈液态，与新鲜组织混合后注入小鼠皮下，于皮温下逐渐凝固，包裹移植组织，形成一个各项因子浓度梯度分布稳定，具有一定免疫隔离作用的肿瘤生长微环境[6]。

李艳等[7]选取64例上皮性卵巢癌组织于裸小鼠体内接种，原代成瘤率分别为：浆液性腺癌52.5%、子宫内膜样腺癌62.5%、透明细胞腺癌71.43%、低分化腺癌60%、黏液性腺癌0，裸鼠间传代成功率达94.12%。本实验接种组织为黏液性腺癌，接种结果表明，裸小鼠体内难成瘤的人卵巢癌细胞，能够在NOD/SCID小鼠体内成瘤，且瘤体生长速度及转移率均增高，深度免疫功能缺陷小鼠，能够为肿瘤细胞提供一个更为优良的生长环境。同时，Matrigel能够在一定程度上促进肿瘤细胞生长。原代移植瘤PDX1传代于裸小鼠后，PDX2及PDX3成瘤率均接近100%，分析其可能原因为人卵巢癌组织移植小鼠后，癌细胞进入重新适应小鼠组织内环境的过程，其中分化较低、侵袭性较高的肿瘤细胞得以保留并继续克隆，每次传代相当于一次筛选，恶性程度逐渐增高，同时部分间质细胞被小鼠间质细胞替代，异种免疫原性降低，肿瘤细胞生长微环境逐渐趋向稳定，成瘤率也随之增高。

Scott等[8]认为，初发患者手术标本建立的PDX模型能够很好地模拟复发后卵巢癌的发生、发展过程，并可先于临床复发进行治疗方案筛选，为复发患者的有效治疗抢得先机，然而目前PDX的建模时间需要至少4～8个月[9]。本实验对PDX建模方法进行改进，结合Matrigel的使用，根据NOD/SCID小鼠及裸小鼠的优缺点，首先在NOD/SCID小鼠皮下建立数只原代种鼠模型，后采用裸小鼠进行稳定传代迅速扩大荷瘤小鼠规模，建立了一种成瘤率高、成本低、观察周期较长、传代稳定易复制的小鼠荷瘤模型。不过，本实验也存在以下不足：(1)标本来源于临床手术患者，对于非手术患者无法建模，今后应在实验中尝试采用临床穿刺活检组织或腹腔积液细胞进行移植建模。(2)由于免疫缺陷鼠的使用，导致该模型无法预知免疫功能对肿瘤的杀伤作用，不适用于生物免疫治疗相关研究。(3)瘤体仅传至第3代，模型例数较少，同时缺乏人源肿瘤间质细胞相关检测，不足以充分观察传代后移植瘤生长及微环境变化情况，还需进一步深入完善。

[1] 孙丽丽, 贾 薇, 常 彬. 卵巢癌化疗耐药机制研究进展[J]. 临床与实验病理学杂志, 2013,29(11):1229-1231.

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暨南大学附属第一医院妇科，广州 510600

李若玢，女，硕士，医师。E-mail: 373602649@qq.com 王晓玉，女，教授，博士生导师，主任医师，通讯作者。 E-mail: wxyjnu@icloud.com

时间：2017-8-20 15:27 网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170820.1527.024.html

R 737.31

B

1001-7399(2017)08-0925-03

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.08.024

接受日期：2017-04-20