高效液相色谱梯度洗脱法测定八宝惊风散中钩藤碱、异钩藤碱、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷的含量※

钟 鸣 刘伟锐 杨占东 卢嘉颉 蒋兆健

高效液相色谱梯度洗脱法测定八宝惊风散中钩藤碱、异钩藤碱、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷的含量※

钟 鸣 刘伟锐 杨占东 卢嘉颉 蒋兆健

目的采用多波长高效液相色谱（HPLC）梯度洗脱法建立同时测定八宝惊风散中钩藤碱、异钩藤碱、升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷含量的方法。方法采用C18色谱柱（4.6 mm×200 mm，5 μm）；流速为0.7 ml/min；以乙腈-甲醇（1:4）为流动相A，以0.1%三乙胺溶液为流动相B，梯度洗脱；检测波长：254nm，柱温为30℃。结果钩藤碱、异钩藤碱、升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷质量浓度分别在5.10～102.00 μg/ml（r=0.9994）、5.95～119.00 μg/ml（r=0.9996）、6.10～122.00 μg/ml（r=0.999 9）、5.65～113.00 μg/ml（r=0.9998）时与其峰面积呈良好的线性关系；钩藤碱、异钩藤碱、升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷的平均加样回收率分别为97.66%、96.72%、98.99%、99.16%，RSD（n=6）分别为 1.32%、0.52%、0.78%、1.56%。结论该方法是一种快速、灵敏、准确的分析方法，可作为八宝惊风散的含量控制方法。

八宝惊风散；钩藤碱；异钩藤碱；升麻素苷；5-O-甲基维斯阿米醇苷

在我国卫生管理部门颁布的药品标准中药成方制剂（第20册）中，八宝惊风散主要中药成分有钩藤、防风、天麻（制）、黄芩、天竺黄、全蝎（制）、沉香、丁香、冰片、茯苓、麝香、薄荷、川贝母、金礞石（煅）、胆南星、人工牛黄、珍珠、龙齿、栀子等19味，该制剂具有祛风化痰、退热镇惊的疗效，是小儿惊风、发烧咳嗽、呕吐痰涎等症状的临床常用药物[1-2]。八宝惊风散处方中主药是钩藤和防风，2012年卫生管理部门颁布的标准未对该方中相关物质含量进行量化规定，从而对该药的制剂工艺研究和临床用药产生一定的阻碍，为有效控制其质量和药效，本研究将通过高效液相色谱（HPLC）法对八宝惊风散中主药有效成分钩藤所含钩藤碱、异钩藤碱和防风所含升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷进行量化研究。

1 仪器与试剂

1.1 试验仪器1200型HPLC色谱仪采用Chemstation色谱工作站（购自美国安捷伦 Agilent科技公司）；VS-100UE型恒温超声波提取机（购自江苏无锡沃信仪器有限公司）。

1.2 试验试剂钩藤碱对照品（批号：76-66-4，纯度：98.0%）购于贵州迪大科技有限责任公司；异钩藤碱对照品（批号：111927-201102，纯度：100.0%）、升麻素苷（批号：111522-201310，纯度：95.0%）、5-O-甲基维斯阿米醇苷（批号：111523-201208，纯度：96.4 %）均购于中国食品药品检定研究院；八宝惊风散（每瓶装 0.26g；批号：140513、140514、140515）购于江西民济药业有限公司；流动相中三乙胺为分析纯试剂（购自天津市富宇精细化工有限公司)；流动相甲醇、乙腈为色谱纯试剂（购自天津市大茂化学试剂厂)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件本实验色谱柱采用大龙依利特 C18柱（规格为4.6 mm×200 mm，填料粒径为5 μm）；参照已有文献和预实验，按比例乙腈-甲醇（1:4）混合为流动相 A，0.1%三乙胺溶液为流动相 B，采用梯度洗脱方法（0～10min，65.0%A；10～22 min，65.0%→50.0%A；22～45min，50.0%A→40.0%A；45～50 min，40.0%A→65.0%A）[3-7]；检测波长254 nm[8-10]；每分钟流量为0.7 ml；柱温为30℃；每次进样量20 μl。在此色谱条件下，所测处方中主要药效成分与其他成分能达到较好的分离效果，按异钩藤碱计理论塔板数≥3000，分离度≥2.0。

2.2 对照品溶液的配制依次分别称取钩藤碱、异钩藤碱、升麻素苷和 5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品适量，置于4个20 ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成钩藤碱、异钩藤碱、升麻素苷和 5-O-甲基维斯阿米醇苷质量浓度分别为0.510 mg/ml、0.595 mg/ml、0.610 mg/ml和0.565 mg/ml对照品溶液，配制完成储存于4℃冰箱，备用。对上述对照品母液精密吸取1.5 ml、1 ml、2 ml、4 ml分别置于 50 ml容量瓶，以甲醇进行补足至刻度，摇匀，即得钩藤碱、异钩藤碱、升麻素苷与 5-O-甲基维斯阿米醇苷质量浓度分别为 0.0153 mg/ml、0.0119 mg/ml、0.0244 mg/ml、0.0452 mg/ml的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备取八宝惊风散适量，研细，取研细粉末10.0 g，并精密称量，放入100 ml具塞三角锥形瓶，于电子分析天平中去皮归零；另外精密量取50 ml甲醇加入锥形瓶，并记录称量值；将上述三角锥形瓶置于恒温超声波中（功率200 W，频率20 kHz），超声处理40 min；超声结束将超声液自然冷却后，称量整个三角锥形瓶重量，将缺失的甲醇进行补足，并摇匀；然后，用0.45 μm针式过滤器进行过滤，取其续滤液，即为本实验的供试品溶液，保存备用。

2.4 阴性对照溶液的制备依据药品标准中药成方制剂（第20册）中八宝惊风散处方中药的组成比例，分别称取无钩藤的所有中药 1份和无防风的所有中药1份，分别按制剂工艺制备与八宝惊风散工艺一致的钩藤空白样品和防风空白样品。制备后的空白样品同上2.3项下的处理方法进行配液，制成钩藤阴性对照溶液、防风阴性对照溶液。

2.5 专属性实验按 2.1项色谱条件，依次对八宝惊风散对照品溶液、供试品溶液、钩藤阴性对照溶液和防风阴性对照溶液进样，测定相应物质的含量。结果：供试品溶液中吸收峰的保留时间与对照品溶液中的钩藤碱、异钩藤碱、升麻素苷和 5-O-甲基维斯阿米醇苷吸收峰对应一致，说明供试品溶液含有对应的物质；但钩藤阴性对照溶液中未见钩藤碱和异钩藤碱色谱吸收峰；防风阴性对照溶液谱图中未见升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷吸收峰（图1）。

2.6 线性关系考察取5支10 ml容量瓶分别标号1-5号进行标注，另精密吸取已配制的对照品母液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 ml依次置于容量瓶，并用甲醇定容，摇匀。按 2.1项色谱条件进行分析测定，根据HPLC色谱图中相应物质的峰面积A及其相应的质量浓度 C，得钩藤碱回归方程为：A=2.2086×104C+267.1，r=0.9994，线性范围为 5.10～102.00 μg/ml；异钩藤碱A=2.0685×104C－300.7，r=0.9996，线性范围为 5.95～119.00 μg/ml；升麻素苷 A=5.5143×104C+404.5，r=0.9999，线性范围为 6.10～122.00 μg/ml；5-O-甲基维斯阿米醇苷 A=6.3597×104C+511.6，r=0.9998，线性范围为 5.65～113.00 μg/ml。结果表明：钩藤碱、异钩藤碱、升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷均有相应的线性范围，因此通过该方法进行测定的对照品物质具有良好的线性关系。

图1 钩藤碱、异钩藤碱、升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷的HPLC

2.7 精密度试验为考察仪器设备的精密度，精密量取2.2项中制备具的对照品溶液20 μl并按HPLC法进样，按2.1项中色谱条件进行设定，通过峰面积计算各组分含量，重复上述操作共 6次，依据每次测定得到的峰面积计算4种成分钩藤碱、异钩藤碱、升麻素苷和 5-O-甲基维斯阿米醇苷的标准偏差，其结果分别为0.83%、0.94%、0.55%和0.61%，因此该HPLC仪器设备具有良好的精密度。

2.8 重复性试验为考察八宝惊风散测定方法的重现性的优劣，选取任意批号的八宝惊风散，称取该批号药品6份作为供试品，按2.3项处理方法进行配制，按2.1项色谱条件进行设定，依据每份供试品测定的峰面积计算 4种成分钩藤碱、异钩藤碱、升麻素苷和 5-O-甲基维斯阿米醇苷的标准偏差，其结果分别为0.82%、0.64%、0.57%和0.42%，因此该测定方法具有良好的重现性。

2.9 稳定性试验为考察八宝惊风散供试品溶液的稳定性，选取任意批号的八宝惊风散，称取该批号药品1份作为供试品，按2.3项处理方法进行配制，配制后的溶液放置于室温条件中，分别在0、2、4、8、12、24 h时精密量取20 μl，按2.1项方法进行测定，依据不同时点测定的峰面积计算 4种成分钩藤碱、异钩藤碱、升麻素苷和 5-O-甲基维斯阿米醇苷的标准偏差，其结果分别为 0.76%、0.88%、0.51%和0.49%，因此24 h内八宝惊风散供试品溶液具有良好的稳定性。

2.10 加样回收率试验称取已知各主要成分含量的八宝惊风散（钩藤碱为 0.079 mg/g、异钩藤碱为0.063 mg/g、升麻素苷为0.121 mg/g、5-O-甲基维斯阿米醇苷为0.218 mg/g）适量，研细，精密称取研细粉末5.0 g，放入100 ml具塞三角锥形瓶，于电子分析天平中去皮归零；另外精密量取25 ml甲醇和25 ml已制备的对照品溶液加入该锥形瓶，并记录称量值；将上述三角锥形瓶放入恒温超声波中（功率200 W，频率20 kHz），超声处理40 min；超声结束后将超声液自然冷却后，称量整个三角锥形瓶重量，将缺失的甲醇补足，摇匀；然后，用0.45 μm针式过滤器进行过滤，取其续滤液，作为本实验的加样供试品试液，储存备用。测定的色谱条件按2.1项方法进行设定，依据测定的峰面积计算各组分回收率，结果见表1。

2.11 样品测定选取不同批号的八宝惊风散3份作为待测样品，按2.3项方法进行待测溶液的配制，精密吸取待测样品溶液20 μl并按HPLC方法进样，按2.1项色谱条件进行设定，通过峰面积计算钩藤碱、异钩藤碱、升麻素苷和 5-O-甲基维斯阿米醇苷组分含量，结果见表2。

3 讨论

3.1 供试品制备提取时间的选择，在试验过程中分别对供试品制备时的超声提取时间进行了对比研究，在超声波（功率200 W，频率20 kHz）条件下分别超声处理20 min、40 min和60 min，对不同超声时间进行考察。各时点超声结果显示，八宝惊风散各主要成分含量由高到底依次为60 min、40 min和20 min，且20 min含量明显低于超声提取40 min和60 min的含量，而超声提取40 min与60 min含量差异不大，因此本测定方法采用超声波（功率200 W，频率20 kHz）条件下超声提取40 min作为八宝惊风散供试品溶液的提取方法。

表1 钩藤碱、异钩藤碱、升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷回收率试验

表2 样品含量测定结果(±s,n=3)

表2 样品含量测定结果(±s,n=3)

批号 钩藤碱(mg/g)异钩藤碱(mg/g)升麻素苷(mg/g)5-O-甲基维斯阿米醇苷(mg/g)140513 0.079±0.001 0.063±0.001 0.121±0.001 0.218±0.002 140514 0.085±0.001 0.067±0.001 0.108±0.001 0.211±0.001 140515 0.081±0.001 0.061±0.001 0.127±0.001 0.227±0.002

3.2 本实验还考察了不同流动相的梯度洗脱方法（甲醇-水、甲醇-0.1%三乙胺溶液、乙腈-0.1%三乙胺溶液、乙腈-甲醇（1:4）与 0.1%三乙胺溶液）对测定八宝惊风散各主要成分含量的影响，结果以乙腈-甲醇（1:4）与 0.1%三乙胺溶液不同比例梯度洗脱分离度效果最佳，峰型对称，各峰之间无重叠，故选取乙腈-甲醇（1:4）与 0.1%三乙胺溶液作为流动相梯度洗脱。

3.3 钩藤为茜草科植物钩藤、大叶钩藤、毛钩藤、华钩藤或无柄果钩藤的干燥带钩茎枝，具有息风定惊、清热平肝的功效，可用于肝风内动、惊痫抽搐、高热惊厥、感冒夹惊、小儿惊啼、妊娠子痫、头痛眩晕等症的治疗；中药防风具有祛风解表、胜湿止痛、止痉的功效，可用于感冒头痛、风湿痹痛、风疹瘙痒、破伤风等症的治疗。钩藤碱和异钩藤碱为钩藤的主要成分，升麻素苷和 5-O-甲基维斯阿米醇苷为防风的主要成分，通过本研究的 HPLC测定方法，能快速、灵敏、准确测定八宝惊风散中的 4个主要成分，为八宝惊风散产品质量控制和量化临床用药提供可靠的方法。

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[2] 中华人民共和国国家药典委员会.中华人民共和国药典(2010年版一部)[S].北京:2010:140,240,附录30,附录36.

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Determination of Rhyncholphylline,Isorhynchophylline,Prim-O-glucosylcimifugin and 5-O-Methylvisammioside in Babao Jingfeng San by HPLC

Zhong Ming Liu Weirui Yang Zhandong Lu Jiajie Jiang Zhaojian

ObjectiveTo develop an HPLC method for the simultaneous determination of Rhyncholphylline,Isorhynchophylline, Prim-O-glucosylcimifugin and 5-O-Methylvisammioside in Babao Jingfeng San.MethodsThe chromatograhic separation was performed on C18column(4.6 mm×200 mm,5 µm),A linear elution of acetonitrilemethanol(1:4) and 0.1% triethylamine solution was adopted at the flow rate of 0.7 ml/min.The detection wavelength were 254 nm.The column temperature was 30℃.ResultsRhyncholphylline,Isorhynchophylline,Prim-O-glucosylcimifugin and 5-O-Methylvisammioside had good linearity at 5.10～102.00 μg/ml(r=0.9994)、5.95～119.00 μg/ml(r=0.9996)、6.10～122.00 μg/ml(r=0.9999)、5.65～113.00 μg/ml(r=0.9998),respectively.The average recoveries and RSD were 97.66%(1.32%),96.72%(0.52%), 98.99%(0.78%) and 99.16%(1.56%),respectively.Conclusion The method was simple,convenience and may be used in the determination of Rhyncholphylline,Isorhynchophylline,Prim-O-glucosylcimifugin and 5-O-Methylvisammioside in Babao Jingfeng San.

Babao Jingfeng San;Rhyncholphylline;Isorhynchophylline;Prim-O-glucosylcimifugin;5-O-Methylvisammioside

10.12010/j.issn.1673-5846.2017.08.010

广州白云山汉方现代药业有限公司，广东广州 510240

国家发展和改革委员会2011年国家工程研究中心创新能力建设项目（编号：发改办高技[2011]1896号）

钟鸣（1973.2-），硕士，制药高级工程师。主要从事中药/天然药物的研究与开发工作。Email：gzmingzhong@126.com

蒋兆健（1968.3-），博士，主任药师。主要从事新药的研究与开发工作。Email：jzj100508@163.com