胃癌患者血清LINC00978表达及其临床意义*

黄振华，梁炜，潘磊，张鹏，付敏，钱晖，许文荣，蒋鹏程，张徐

(1.江苏大学医学院，江苏省检验医学重点实验室，江苏镇江 212013；2.江苏大学附属人民医院普外科，江苏镇江 212002)

·液体活检与临床实验研究·

胃癌患者血清LINC00978表达及其临床意义*

黄振华1,2，梁炜1，潘磊1,2，张鹏1，付敏2，钱晖1，许文荣1，蒋鹏程2，张徐1

(1.江苏大学医学院，江苏省检验医学重点实验室，江苏镇江 212013；2.江苏大学附属人民医院普外科，江苏镇江 212002)

目的 检测胃癌患者血清中LINC00978表达水平，评估其表达水平与临床病理参数的关系，并探讨其临床诊断价值。方法 实时荧光定量RT-PCR检测LINC00978在胃癌细胞、体检健康者、胃良性疾病及胃癌患者血清中的表达水平，分析其与胃癌患者临床病理参数的相关性，并用ROC曲线分析其诊断效能。结果LINC00978在人胃癌细胞系MGC-803中的表达水平(18.88±1.15)明显高于胃黏膜上皮细胞(1.00±0.03)，差异有统计学意义(t=-21.926，P<0.05)。LINC00978在胃癌患者血清中的平均含量[3.525(1.385，8.954)]较胃良性疾病患者[0.419(0.258，1.369)]和体检健康者[0.814(0.351，2.510)]均明显升高(Z值分别为-4.834和-4.686；P均<0.01)，且与淋巴结转移、浸润深度和TNM分期相关(r分别为0.448、0.369和0.383，P均<0.01)；胃癌患者术后血清中LINC00978的表达水平[0.17(0.15,0.39)]较术前[0.98(0.59,1.61)]明显降低(Z=-5.731，P<0.01)。与体检健康者相比，LINC00978在胃良性疾病患者血清中表达差异无统计学意义(Z=-1.693，P>0.05)。胃癌患者血清LINC00978的ROC曲线下面积(AUCROC)为0.807，95%可信区间(CI)为0.723～0.882，当cut-off值为1.806时，其诊断胃癌的敏感性为71.4%，特异性为75.9%。结论LINC00978在胃癌患者血清中呈高表达，且与淋巴结转移、浸润深度和TNM分期相关，有望成为潜在的胃癌诊断的生物学标志物。

胃癌；LINC00978；血清；生物学标志物

长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一类长度大于200个核苷酸的转录本，无蛋白质编码功能。lncRNA种类繁多，结构各异，在染色体修饰、转录及转录后调节、表观遗传调控等方面发挥重要作用，广泛参与机体生理和病理过程[1-2]。近年来的研究发现，lncRNA异常表达与胃癌发生、发展以及转移等过程密切相关，有望成为胃癌诊断、预后和治疗的新靶点[3-6]。本研究检测胃癌患者血清中LINC00978表达水平，分析其与临床病理参数的相关性，并评估血清LINC00978作为胃癌诊断新指标的潜能。

1 材料和方法

1.1 研究对象 收集2015年4月至2017年1月江苏大学附属人民医院普外科就诊的胃癌患者63例，男45例，女18例，年龄35～88岁，中位年龄63岁。纳入标准：(1)经病理组织学活检确诊为胃癌；(2)术前未行放化疗或全身治疗；(3)无严重其他系统疾患。排除其他肿瘤病史以及术前行化疗或放疗等辅助治疗的患者,且均无严重的肝肾功能损伤。收集胃癌患者临床病理参数，包括性别、年龄、肿瘤大小、分化程度、淋巴结转移、浸润深度和TNM分期等。选取同期就诊且年龄和性别匹配的胃良性疾病患者20例，男13例，女7例，年龄33～74岁，中位年龄58岁，均经胃镜明确诊断为胃炎，且不患有其他消化系统疾病史。选取38例同期年龄和性别匹配的体检健康者作为对照，男26例，女12例，年龄37～76岁，中位年龄61岁。样本采集经江苏大学附属人民医院伦理委员会批准，患者均知情同意。

1.2 血清样本采集及处理 采集各研究对象治疗前(体检健康者于体检时)及胃癌患者术后1周时空腹静脉血2 mL，4 ℃、3 000×g离心10 min分离血清，4 ℃、12 000×g离心10 min以去除细胞碎片，血清分装后置-80 ℃保存。

1.3 细胞系、主要试剂和仪器 人胃粘膜上皮细胞系GES-1、人胃癌细胞系MGC-803购自中国科学院上海细胞库；高糖DMEM培养基、RPMI 1640培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、Trizol试剂(美国Gibco公司)，QIAzol裂解液、血清RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒(美国Qiagen公司)，2×SYBR Green PCR Master Mix(康为世纪公司)；CFX96荧光定量PCR仪(美国Bio Rad公司)，NanoDrop2000超微量分光光度计(美国Thermo公司)。

1.4 细胞培养 取生长状态良好的GES-1细胞，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基常规培养；取生长状态良好的MGC-803细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养，细胞均置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养。

1.5 RNA提取及逆转录反应 用Trizol试剂提取GES-1和MGC-803(1×106个)细胞总RNA，用QIAzol裂解液提取胃癌患者、胃良性疾病患者及体检健康者血清中总RNA，NanoDrop 2000超微量分光光度计检测RNA浓度和纯度，取吸光度(A260/280 nm)为1.8～2.0的RNA样本，按逆转录试剂盒说明书逆转录为cDNA，置于-20 ℃保存。

1.6 引物设计与合成 利用Primer Premier 5.0软件设计LINC00978(NR_024373.2)和U6(NG_043158.2)引物序列，并由上海英潍捷基公司合成。LINC00978上游引物(F)：5′-AGGCCCCAGGGAATCTTTCA-3′；下游引物序列(R)：5′-GCCTCTCCCTGAATAACTGGG-3′，产物片段大小为158 bp。U6上游引物序列(F)：5′-CTCGCTTTGGCAGCACA-3′；下游引物序列(R)：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′，产物片段大小为94 bp。

1.7 实时荧光定量RT-PCR 采用CFX96实时荧光定量PCR仪进行分析，按照UltraSYBR实时荧光定量RT-PCR Mixture试剂盒说明书配置反应体系。PCR总反应体积为20 μL，包括2×SYRR Green PCR Master Mix 10 μL、上、下游引物(5 mmol/L)各0.3 μL，cDNA模板1.5 μL，RNase free ddH2O 7.9 μL。循环参数：95 ℃预变性10 min；94 ℃ 20 s，56 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，共40个循环。LINC00978的相对表达水平用2-△△Ct法计算，公式：△△Ct=[(样本Ct目的基因-样本Ct管家基因)-(对照组Ct目的基因-对照组Ct管家基因)]。

2 结果

2.1LINC00978在胃癌细胞中的表达 实时荧光定量RT-PCR检测结果显示，与GES-1细胞(1.00±0.03)相比，LINC00978在MGC-803细胞中的表达水平(18.88±1.15)明显升高，差异有统计学意义(t=-21.926，P<0.05)。

2.2LINC00978在胃癌患者血清中的表达LINC00978在胃癌患者血清中的含量[3.525(1.385，8.954)]较胃良性疾病患者[0.419(0.258，1.369)]和体检健康者[0.814(0.351，2.510)]均明显升高(Z值分别为-4.834和-4.686；P均<0.01)，而胃良性疾病患者血清中LINC00978含量与体检健康者相比差异无统计学意义(Z=-1.693，P>0.05)。此外，在10例胃癌患者术前术后血清样本中的9例胃癌患者术后血清LINC00978表达水平[0.17(0.15,0.39)]较相应的术前表达水平[0.98(0.59,1.61)]明显降低(Z=-5.731，P<0.01)。

2.3LINC00978与胃癌患者临床病理参数的相关性分析 结果显示，LINC00978的表达水平与胃癌患者淋巴结转移、浸润深度以及TNM分期有关，而与性别、年龄、分化程度、肿瘤大小及血管或神经受累无关。见表1。

表1 胃癌患者血清LINC00978表达水平与临床病理参数的关系

2.4 胃癌患者血清LINC00978的ROC曲线及诊断效能分析 以胃良性疾病患者和体检健康者作为对照组(58例)，胃癌患者作为疾病组(63例)，绘制ROC曲线分析胃癌患者血清LINC00978的诊断价值。胃癌患者血清LINC00978的ROC曲线下面积(AUCROC)为0.807，95%可信区间(CI)为(0.732～0.882)，当cut-off 值为1.806时，敏感性为71.4%，特异性为75.9%，见图1。

图1 血清LINC00978诊断胃癌的ROC曲线

3 讨论

LncRNA的功能及作用已成为肿瘤领域的研究热点。研究表明，多种lncRNA在胃癌中异常表达，包括AFAP1-AS1[7]、HOXA11-AS[8-9]、CRNDE[10]、ZFAS1[11]和DANCR[12]等，这些lncRNA通过多种机制参与胃癌的发生、发展。血浆、血清以及其他体液标本中含有核酸分子。早期研究报道肿瘤患者血清中存在异常表达的DNA，可作为预后和预测的生物学标志物[13]。最新研究发现，一些RNA分子(如miRNA、lncRNA)也可稳定地存在于血清中，因此可作为肿瘤早期诊断的潜在标志物[13]。如GACAT2在胃癌患者血浆中表达明显增加，在术后患者血浆中表达降低，其表达水平与淋巴结转移、远处转移和周围神经侵袭明显相关，血浆GACAT2可作为胃癌筛查和疗效预测的分子标志物[14]。H19在胃癌患者血浆中表达上调，表达水平与TNM分期相关；研究表明，当cut-off值为0.5时，AUCROC为0.724，敏感性为68.75%，特异性为67.67%。当H19与CEA联合应用时，AUCROC可达0.804[15]。

LINC00978(又称AK001796、MIR4435-2HG)位于染色体2q13上。Yang等[16]首次发现其在肺癌组织中呈过表达。Deng等[17]研究发现，LINC00978在乳腺癌细胞和乳腺癌组织中表达上调，生存曲线分析结果显示LINC00978高表达提示预后不良，可作为乳腺癌患者预后判断的良好指标。然而，LINC00978在胃癌中的表达情况仍不清楚，到目前为止，国内尚未见LINC00978在胃癌中的相关报道。本研究发现胃癌患者血清中可检测出LINC00978，且胃癌患者血清LINC00978表达水平较胃良性疾病患者和体检健康者明显增加，表明LINC00978在胃癌中表达上调，这与Ke等[13]报道的胃癌组织lncRNA表达谱芯片结果相一致。本研究还发现胃癌患者血清LINC00978高表达与淋巴结转移、肿瘤浸润和TNM分期相关，提示LINC00978可能是参与胃癌恶性进展的重要lncRNA分子。本研究还发现胃癌患者术后血清LINC00978表达水平较术前明显降低，提示LINC00978可作为监测手术治疗效果的可靠指标。ROC曲线分析显示胃癌患者血清LINC00978的AUCROC达0.807。LINC00978能否与其他指标联合应用以提高诊断效能仍值得深入研究。此外，血清LINC00978的表达水平与胃癌患者的预后关系也有待进一步探讨。

LINC00978在肿瘤中的作用机制尚不明确，目前仅有Deng等[17]报道LINC00978敲减导致肺癌细胞增殖能力明显抑制。抑制LINC00978表达可诱导细胞周期阻滞于G0/G1期，引起细胞周期相关基因如CDC6和CDK1等表达改变[16]，提示LINC00978可能参与调控细胞周期进程，促进肿瘤细胞增殖。我们将在今后研究中深入探讨LINC00978在胃癌中的生物学作用及分子机制，以进一步明确其在胃癌诊断中的应用价值。

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(本文编辑：许晓蒙)

Expression of serumLINC00978 in gastric cancer patients and its clinical significance

HUANGZhen-hua1, 2,LIANGWei1,PANLei1, 2,ZHANGPeng1,FUMin1,QIANHui1,XUWen-rong1,JIANGPeng-cheng1,ZHANGXu1

(1.JiangsuKeyLaboratoryofMedicalScienceandLaboratoryMedicine,SchoolofMedicine,JiangsuUniversity,Zhenjiang212013,Jiangsu; 2.DepartmentofGeneralSurgery,theAffiliatedPeople'sHospitalofJiangsuUniversity,Zhenjiang212002,Jiangsu,China)

Objective To investigate the expression levels of serumLINC00978 in gastric cancer patients and its correlation with clinicopathological characteristics, and evaluate its clinical diagnostic value. Methods The expression levels ofLINC00978 in gastric cancer cells and serum samples from the patients with gastric cancer or gastric benign diseases and healthy controls were detected by real-time qRT-PCR, and its correlations with clinicopathological parameters were analyzed. The diagnostic efficacy of serumLINC00978 was evaluated by the receiver operating characteristic (ROC) curve. Results The expression levels ofLINC00978 in MGC-803 cells were significantly higher than that in GES-1 cells (18.88±1.15 vs 1.00±0.03,t=-21.926,P<0.05). The expression levels (median[P25,P75]) of serumLINC00978 in gastric cancer patients (3.525[1.385, 8.954]) were significantly higher than those in the patients with gastric benign diseases (0.419[0.258, 1.369],Z=-4.834,P<0.01) and healthy controls (0.814[0.351, 2.510],Z=-4.686,P<0.01). The expression levels of serumLINC00978 in gastric cancer patients were significantly related to lymphatic metastasis (r=0.448,P<0.01), invasive depth (r=0.369,P<0.01) and TNM stage (r=0.383,P<0.01), and those after operation significantly lower than before operation (0.17[0.15,0.39] vs 0.98[0.59,1.61],Z=-5.731,P<0.01). There was no significant difference in serumLINC00978 levels between the patients with gastric benign diseases and healthy controls (Z=-1.693,P>0.05). The area under the ROC curve (AUCROC) and 95% confidence interval (CI) of serumLINC00978 levels in the diagnosis of gastric cancer were 0.807 and 0.732-0.882, respectively. When the cutoff value was 1.806, the sensitivity and specificity for the diagnosis of gastric cancer were 71.4% and 75.9%, respectively. Conclusion The expression levels of serumLINC00978 in gastric cancer patients increase and are related to lymphatic metastasis, invasive depth and TNM stage, which may be served as a novel biomarker for the diagnosis of gastric cancer.

gastric cancer;LINC00978; serum; biomarker

10.13602/j.cnki.jcls.2017.08.04

国家自然科学基金面上项目(81572075, 81672416)；江苏省自然科学基金面上项目(BK20141303)；江苏省重点研发计划(社会发展)项目(BE2015667)；镇江市重点研发计划(社会发展)项目(SH2015034)；江苏省“青蓝工程”，江苏省“333工程”。

黄振华，1992年生，男，硕士研究生，从事胃肠道肿瘤诊断研究。

张徐，副教授，博士研究生导师，E-mail：xuzhang@ujs.edu.cn；蒋鹏程，主任医师，硕士研究生导师，E-mail:jpc18906106623@126.com。

R375.2

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2017-05-22)