纳米金探针液相杂交法检测核酸序列依赖扩增产物诊断侵袭性曲霉病*

吴文耀,华若伊,杜丽,蒲清泉,严佳,杨蜜,何云燕,夏云

(1.重庆医科大学附属第一医院检验科，重庆 400016；2.重庆市人民医院检验科，重庆 400016)

·临床检验技术研究·

纳米金探针液相杂交法检测核酸序列依赖扩增产物诊断侵袭性曲霉病*

吴文耀1,华若伊1,杜丽1,蒲清泉1,严佳1,杨蜜1,何云燕2,夏云1

(1.重庆医科大学附属第一医院检验科，重庆 400016；2.重庆市人民医院检验科，重庆 400016)

目的 建立纳米金探针液相杂交法检测核酸序列依赖扩增(nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)产物，用于快速诊断侵袭性曲霉病(IA)。方法 采用NASBA扩增曲霉菌属特异性18S rRNA保守序列，扩增产物与5′端经巯基化俢饰的特异性纳米金探针进行液相杂交，用该法检测106例临床血液标本(14例确诊，32例拟诊，60例未感染IA),并与GM试验结果进行比较以评价该方法的准确性。结果 纳米金探针只与曲霉菌属菌株的NASBA产物出现阳性杂交反应，而其他非曲霉菌均为阴性。NASBA-纳米金液相杂交法检测106例临床标本的敏感性和特异性分别为82.61%(38/46)、81.67%(49/60),ROC曲线下面积(AUCROC)为0.890。GM试验检测的敏感性和特异性分别为56.52%(26/46)和83.33%(50/60)，AUCROC为0.723。结论 NASBA-纳米金液相杂交技术检测曲霉菌感染具有敏感性高、特异性强、操作简单的特点，适合实验室常规开展。

核酸序列依赖扩增；侵袭性曲霉病；曲霉菌；纳米金探针

侵袭性曲霉病(Invasive aspergillosis,IA)是一种严重的系统性真菌感染，特别是近年来临床上广泛使用免疫抑制剂、细胞毒药物及化疗药物，使其在免疫抑制或者免疫低下患者中的发病率和病死率明显上升[1-2]。分子生物学检测较传统的培养和涂片等方法具有更高的准确性，但因人员和设备要求等原因临床应用较少。核酸序列依赖扩增(nucleic acid sequence-based amplification,NASBA)是基于PCR扩增发展起来的一项新型的恒温、敏感的核酸扩增技术，在2 h内可将靶基因RNA扩增109～1012倍[3]，扩增效率高且不易受到DNA的污染。NASBA产物多采用琼脂糖凝胶电泳检测，该法虽然操作简单，但由于产物是单链RNA容易降解[4]，从而影响检测的敏感性。近年来，纳米金粒子用于检测DNA[5]、RNA[6]、蛋白质[7]和金属离子[8]等已多见报道，该方法操作简单，特异性及敏感性高，结果形成肉眼可见的颜色变化或者在反向色谱盘上可现黑色的凝集颗粒便于观察，且不需任何仪器设备，便于临床开展，达到早期、快速检测IA的目的。本研究旨在建立一种NASBA联合纳米金探针技术检测血清标本中曲霉菌属特异性18S rRNA保守序列用以诊断IA。

1 材料和方法

1.1 病例选择 根据欧洲癌症研究和治疗组织/侵袭性真菌感染协作组和美国变态反应和感染病研究院真菌病研究组(EORTC/MSG )2008 年修订的定义为诊断标准[9]，将确诊、拟诊归为阳性病例，收集我院自2014年9月至2016年4月共106份临床血液标本，其中46例为IA感染病例(14例为确诊，32例为拟诊)，其余60例为排除曲霉感染的病例。血液标本离心分离血清后,分装于离心管中，置-80 ℃保存。

1.2 菌株来源 标准菌株烟曲霉CMCC A1a、黄曲霉ATCC 204304、黑曲霉ATCC 16404、构巢曲霉ATCC 24919、金黄色葡萄球ATCC 29213、铜绿假单胞菌ATCC 27853、大肠埃希菌ATCC 25922、白色念珠菌ATCC 64548、近平滑念珠菌ATCC 22019、克柔念珠菌ATCC 6258、肺炎克雷伯菌ATCC 700603均为本实验室保藏。新型隐球菌FY 226、鲍曼不动杆菌、阴沟肠杆菌、热带念珠菌、茄病镰刀菌、尖端赛多孢菌均为临床分离菌株。

1.3 仪器与试剂 核酸扩增仪(美国Applied Biosystems公司),凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司)，Trizol试剂(Invitrogen公司)，AMV反转录酶、核糖核酸酶H(RNase H)、核糖核酸酶抑制剂RNasin(Promega公司)，NTP、dNTP、T7 RNA聚合酶(TaKaRa公司)，血液总RNA快速提取试剂盒(北京百泰克生物公司)，曲霉菌半乳甘露聚糖检测试剂盒(Bio-Rad公司)，直径60 nm胶体金溶液(南京先锋纳米材料公司)，反向色谱盘(青岛海浪公司)。

1.4 引物及探针 为提高检测敏感性，曲霉菌扩增的靶序列针对具有属特异性的多拷贝的18S rRNA 保守序列区[10]，采用文献[11]报道的引物和探针序列，上游引物序列: 5′-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGGAGCAAAGGCCTGCTTTGAACA-3′，下划线部分含有T7启动子序列；下游引物序列:5′-GCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATA-3′; 杂交探针序列：5′-GGTCCGCCTCACCGCGAGTACTG-3′，其5′端经巯基化俢饰，由上海生工公司合成。

1.5 NASBA-纳米金液相杂交技术

1.5.1 纳米金探针的制备 按参考文献[12-13]的方法并稍加改进，取800 μL纳米金溶液，12 000×g离心30 min，弃上清，加46 μL TE缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl,1 mmol/L EDTA)重悬，同时加入4 μL 100 μmol/L的巯基探针，充分混匀，室温避光静置16 h后加入50 μL磷酸盐A(0.2 mol/L NaCl 20 mmol/L PBS pH 7.0)室温避光静置48 h。12 000×g离心30 min后弃上清，加入100 μL磷酸盐B(0.1 mol/L NaCl 10 mmol/L PBS pH 7.0)，12 000×g离心30 min。加入50 μL磷酸盐B重悬酒红色油状物，混匀后置4 ℃保存。

1.5.2 菌株RNA及血清标本RNA提取 用接种环将培养好的曲霉菌刮到研钵(0.1% DEPC处理ddH2O浸泡24 h并高压灭菌)中，加入液氮研磨，然后用Trizol试剂提取。按血液总RNA提取试剂盒说明书操作提取血清中的游离RNA。提取的RNA样本置-80 ℃保存。

1.5.3 NASBA纳米金探针液相杂交 NASBA扩增体系的建立：按参考文献[14]，将扩增后的NASBA产物用75%的无水乙醇(0.1% DEPC处理ddH2O配制)洗涤，12 000×g离心5 min，弃去上清。加入10 μL的杂交缓冲液(1.2 mol/L NaCl,0.02% SDS,20 mmol/L PBS)和10 μL的纳米金探针，65 ℃ 5 min,41 ℃ 5 min反应后，室温避光静置1 h。根据以下两种方法检测杂交产物。方法一：肉眼直接观察，将反应后的EP管置于白色背景下，阳性结果为反应体系颜色由酒红色变成灰蓝色，阴性则无颜色变化。 方法二：反应产物12 000×g离心1 min，吸取管底5 μL反应产物滴在反向色谱反应盘上观察。阳性结果加样中心点有肉眼可见的黑色颗粒，阴性则无黑色颗粒凝集。

1.5.4 NASBA产物电泳检测 配制10 g/L的琼脂糖凝胶和1×TAE电泳缓冲液，每加样孔加5 μL样本，130～150 V恒压电泳20 min，凝胶成像仪扫描并拍照。

1.5.5 NASBA-纳米金探针法临床应用评价 采用GM 试验进行对比分析，按照曲霉菌半乳甘露聚糖检测试剂盒说明书操作检测GM。质控、对照标本的吸光度(A)值通过Tecan酶联仪进行测定，在450/620 nm波长下读取A值，根据样本检测值的计算指数GMI判定，GMI=样本A值均值/cut-off 质控A值均值，若GMI<0.5，则判为阴性，若GMI≥0.5，则判为阳性。用NASBA-纳米金探针法和GM试验分别检测106例临床标本，比较其特异性、敏感性以及ROC曲线下面积(AUCROC)评价两种方法的诊断效能。

2 实验与结果

2.1 特异性试验 将提取的曲霉菌属和非曲霉菌属的细菌及真菌的总RNA采用NASBA方法进行扩增，扩增产物分别进行琼脂糖凝胶电泳和与金纳米探针液相杂交，观察实验特异性。结果显示，只有曲霉菌属菌株提取的RNA经NASBA扩增后，电泳分析示在243 bp位置可见明亮的电泳条带，且NASBA产物与纳米金探针液相杂交后出现由酒红至灰蓝的颜色变化，反向色谱盘出现黑色凝集颗粒，其他非曲霉菌属的细菌及真菌均为阴性。见图1。表明所用的引物和探针具有良好的特异性。

注：A，NASBA产物电泳分析结果；B，NASBA产物与纳米金探针杂交体系颜色变化结果；C，NASBA产物与纳米金探针反向色谱盘上反应结果；1，烟曲霉(CMCC A1a)；2，黑曲霉(ATCC 16404)；3，黄曲霉(ATCC 204304)；4，构巢曲霉(ATCC 24919)；5，金黄色葡萄球菌(ATCC 29213)；6，铜绿假单胞菌(ATCC 27853)；7，大肠埃希菌(ATCC 25922)；8，白色念珠菌(ATCC 64548)；9，新型隐球菌(FY 226)；10，近平滑念珠菌(ATCC 22019)；11，克柔念珠菌(ATCC 6258)；12，肺炎克雷伯菌(ATCC 700603)；13，鲍曼不动杆菌；14，阴沟肠杆菌；15，热带念珠菌；16，茄病镰刀菌；17，尖端赛多孢菌。

图1 NASBA-纳米金探针杂交特异性检测

2.2 临床标本的检测结果 用NASBA-纳米金探针法和GM试验检测临床106份标本。结果表明，NASBA-纳米金探针法检测的敏感性和特异性分别为82.61%(38/46)和81.67(49/60)，ROC曲线下面积(AUCROC)为0.890。GM试验检测的敏感性和特异性分别为56.52%(26/46)和83.33%(50/60)，AUCROC为0.723。见图2。

图2 GM试验和NASBA-纳米金探针试验ROC曲线分析

3 讨论

NASBA是一个等温扩增方法，通过单链RNA扩增可以迅速放大靶基因片段，其敏感性高，特异性好，扩增效率高，在以往的研究中通过系列稀释烟曲霉菌CMCC A1a的孢子，其检测限可达1 CFU/mL[14]。但目前其产物RNA单链检测多通过电泳方法，由于RNA易降解故电泳要求条件较高，且电泳时间过长易导致检测结果出现假阴性，为进一步提高检测的准确性，本研究采用新型的纳米金探针法检测NASBA产物，将巯基修饰的短链寡核苷酸探针固定在纳米金颗粒表面，通过碱基互补配对原理从反应物中捕获靶序列，形成RNA-DNA杂化双链结构，从而降低了金颗粒之间电荷互斥作用，使金颗粒相互聚集成网状交联，形成肉眼可见的颜色变化或反向色谱盘检测检出黑色凝集颗粒。

从本研究结果来看，对106例临床血液标本用GM试验进行检测,其敏感性为56.52%，特异性为83.33%，AUCROC为0.723，尽管GM试验已被纳入EORTC/MSG的标准，但其敏感性较低(56.52%)，特异性尚可(83.33%)，故至少需要检测2次以提高诊断的准确性。而NASBA-纳米金探针方法检测的敏感性及特异性分别为82.61%和81.67%，AUCROC为0.890，表明NASBA-纳米金探针方法对于曲霉菌检测的敏感性较GM试验明显提高，AUCROC明显增大。对IA感染的诊断效能明显优于GM试验，具有良好的发展前景。

实时荧光定量PCR能够通过特异性引物、荧光探针进行实时监测和鉴定，在IA的诊断中应用越来越多。Wang等[15]报道，实时荧光定量PCR检测IA的敏感性和特异性分别为67.65%和89.13%，与本研究相比，该方法具有更高的特异性，表明实时荧光定量PCR对IA高危患者的确诊具有很高的应用价值，但其敏感性仅为67.65%，比本研究建立的NSABA-纳米金探针法的敏感性(82.61%)明显偏低，可能与血清标本中曲霉菌DNA含量低有关。NASBA-纳米金探针法的高敏感性是由于NASBA具有更高的扩增效率，且采用粒径较大的60 nm胶体金颗粒可以提高其表面积，包被更多量的巯基探针，更大限度的捕获反应体系中的目的靶序列，杂交产物离心后可使纳米金聚合产物迅速沉淀，大大提高检测的敏感性。同时本研究对NASBA-纳米金探针方法的特异性进行评估，发现只有模板RNA来自曲霉菌属时琼脂糖凝胶电泳才会在243 bp附近出现电泳条带，反应体系出现阳性杂交反应。而其他非曲霉菌属均未出现条带，杂交反应亦表现为阴性。说明NASBA-胶体金杂交方法具有良好的特异性，此种特异性是由NASBA扩增引物的特异性以及纳米金颗粒探针的特异性双重因素所决定的。

综上所述，本研究结果表明，NASBA-纳米金探针液相杂交诊断IA较为敏感，且只有带T7启动子的引物序列才会被大量扩增，因此不会受到环境DNA污染出现假阳性；纳米金探针制备容易，检测快速，反应体系结果便于观察，不需要专门的仪器设备，非常适合一般实验室常规开展。因此，采用NASBA和纳米金探针联合检测IA的方法颇具临床应用前景，为临床早期诊断IA提供了一种新的方法。

[1]Desbois AC, Poiree S, Snanoudj R,etal. Prognosis of invasive aspergillosis in kidney transplant recipients: a case-control study[J].Transplant Direct, 2016, 2(8):e90.

[2]Avcu G, Karapinar DY, Akinci AB,etal. Utility of the serum galactomannan assay for the diagnosis of invasive aspergillosis in children with acute lymphoblastic leukemia[J]. Int J Infect Dis, 2017, 54:8-12.

[3]Compton J.Nucleic acid sequence-based amplification[J].Nature,1991, 350(6313):91-92.

[4]Rybarczyk A, Jackowiak P, Figlerowicz M,etal. Computational prediction of non-enzymatic RNA degradation patterns[J]. Acta Biochim Pol, 2016,63(4):745-751.

[5]Lau HY, Wu H, Wee EJ,etal.Specific and sensitive isothermal electrochemical biosensor for plant pathogen DNA detection with colloidal gold nanoparticles as probes[J]. Sci Rep, 2017, 7:38896.

[6]Askaravi M, Rezatofighi SE, Rastegarzadeh S,etal. Development of a new method based on unmodified gold nanoparticles and peptide nucleic acids for detecting bovine viral diarrhea virus-RNA[J].AMB Express,2017,7(1):137.

[7]Lin X, Ivanov AP, Edel JB.Selective single molecule nanopore sensing of proteins using DNA aptamer-functionalised gold nanoparticles[J].Chem Sci,2017,8(5):3905-3912.

[8]Kim K, Nam YS, Lee Y,etal.Highly Sensitive colorimetric assay for determining Fe3+ based on gold nanoparticles conjugated with glycol chitosan[J].J Anal Methods Chem,2017,2017:3648564.

[9]De Pauw B,Walsh TJ,Donnelly JP,etal. Revised definitions of invasive fungal disease from the European Organization for Research and Treatment of Cancer /Invasive Fungal Infections Cooperative Group and the National Institute of Allergy and Infectious Diseases Mycoses Study Group (EORTC/MSG) Consensus Group[J].Clin Infect Dis,2008,46(12): 1813-1821.

[10]Perlin DS，Zhao Y. Molecular diagnostic platforms for detecting Aspergillus[J]. Med Mycol, 2009, 47(Suppl 1):S223-S232.

[11]Loeffler J，Hebart H，Cox P，etal.Nucleic acid sequence-based amplification of Aspergillus RNA in blood samples[J]. J Clin Microbiol, 2001, 39(4):1626-1629.

[12]Mirkin CA, Letsinger RL, Mucic RC,etal. A DNA-based method for rationally assembling nanoparticles into macroscopic materials[J].Nature,1996, 382(6592):607-609.

[13]Zhang ZL, Pang DW, Yuan H,etal. Electrochemical DNA sensing based on gold nanoparticle amplification[J]. Anal Bioanal Chem, 2005, 381(4):833-838.

[14]Du L, Xia Y, He Y,etal. Development and evaluation of enzyme-linked immunosorbent assay of nucleic acid sequence-based amplification for diagnosis of invasive aspergillosis[J]. AMB Express, 2016, 6(1):91.

[15]Wang L, He Y, Xia Y,etal. Retrospective comparison of nucleic acid sequence-based amplification, real-time PCR, and galactomannan test for diagnosis of invasive aspergillosis[J].J Mol Diagn,2014,16(5):584-590.

(本文编辑：许晓蒙)

Detection of nucleic acid sequence-based amplification products by gold nanoprobe-based solution hybridization for the diagnosis of invasiveaspergillosis

WUWen-yao1,HUARuo-yi1,DULi1,PUQing-quan1,YANJia1,YANGMi1,HEYun-yan2,XIAYun1

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,theFirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016; 2.DepartmentofClinicalLaboratory,ChongqingPeople′sHospital,Chongqing400016,China)

Objective To establish a method of gold nanoprobe-based solution hybridization (GNBSH) to detect nucleic acid sequence-based amplification (NASBA) products for the rapid diagnosis of invasiveaspergillosis(IA). Methods The Aspergillus specific 18S rRNA was amplified by NASBA and then the amplified products were hybridized with the gold nanoprobes which were modified with thiol compounds at the 5′ end. Serum samples from 106 patients, including 14 with a definite IA, 32 with suspected IA and 60 without IA, were detected by the established method, and the obtained results were compared with that of galactomannan (GM) test to evaluate its accuracy. Results The gold nanoprobes only hybridized with Aspergillus NASBA products but not other non-Aspergillus strains. The sensitivity, specificity and the area under the ROC curve (AUCROC) of the established GNBSH method for detecting 106 clinical samples were 82.61% (38/46), 81.67% (49/60) and 0.890, respectively. The sensitivity, specificity and AUCROCof GM test were 56.52% (26/46), 83.33% (50/60) and 0.723, respectively. Conclusion The established GNBSH method to detect Aspergillus NASBA products has high sensitivity and specificity and simple operation, which may be used to detect the infection of Aspergillus by clinical laboratories.

nucleic acid sequence-based amplification; invasiveaspergillosis; Aspergillus; gold nanoprobe

10.13602/j.cnki.jcls.2017.08.09

重庆市基础与前沿研究计划项目(20160129)。

吴文耀，1991年生，女，硕士研究生，主要从事微生物方向研究。

夏云，主任技师，E-mail：xiayun12cn@aliyun.com。

R446.5

A

2017-05-28)