血清miR-216a检测在急性胰腺炎诊断及预后监测中的价值*

陆攀，宋佳希，王锋，闫静，万淑君，汪俊军

(南京大学医学院附属金陵医院临床检验科，南京 210002)

·液体活检与临床实验研究·

血清miR-216a检测在急性胰腺炎诊断及预后监测中的价值*

陆攀，宋佳希，王锋，闫静，万淑君，汪俊军

(南京大学医学院附属金陵医院临床检验科，南京 210002)

目的 检测急性胰腺炎(AP)患者血清miR-216a的表达水平，探讨其作为AP诊断及预后监测指标的临床应用价值。方法 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测80例轻症急性胰腺炎(MAP)、80例重症急性胰腺炎(SAP)患者及74例健康人对照血清miR-216a的表达水平。全自动生化免疫分析仪检测各组淀粉酶(AMY)、脂肪酶(LPS)、Ca2+、葡萄糖(Glu)、红细胞比容(HCT)、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)和C反应蛋白(CRP)等指标。 ROC曲线及相关性分析评估miR-216a对AP患者的临床应用价值。结果 与健康人对照组[(11.12×10-5(5.83×10-5，19.12×10-5)]相比，AP患者血清miR-216a的水平 [38.49×10-5(24.05×10-5，62.02×10-5)]明显升高(U=-9.10，P<0.01)。但MAP与SAP患者血清miR-216a水平[分别为36.46×10-5(22.29×10-5，55.80×10-5),40.44×10-5(25.84×10-5，65.48×10-5)]差异无统计学意义(U=-0.96,P>0.05)。miR-216a用于鉴别对照组和AP患者的ROC曲线下面积(AUCROC)为0.870(95%CI:0.825～0.915)，cut-off值为0.61；用于鉴别对照组和MAP患者的AUCROC为0.865(95%CI:0.808～0.921)，cut-off值为0.59；用于鉴别对照组与SAP患者的AUCROC为0.876 (95%CI:0.822～0.930)，cut-off值为0.66。AP患者治疗好转后，其血清miR-216a的表达水平由[41.88×10-5(24.24×10-5，64.44×10-5)]下降至[20.58×10-5(11.01×10-5，41.91×10-5)]，差异有统计学意义(U=5.24，P<0.01)。相关性分析结果显示，AP患者血清miR-216a的表达水平与CRP呈正相关(r=0.215P=0.006)。结论 AP患者血清miR-216a水平明显升高，可用于AP辅助诊断及预后监测。

急性胰腺炎；miR-216a；生物学标志物；预后监测

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)的发生、发展是一个复杂的过程，涉及生活方式和饮食习惯在内的多种因素，但其发病机制目前仍不清楚[1]。临床上对AP的诊断主要基于患者的临床症状和体征，影像学检查(CT和MRI)和实验室检测指标[血清淀粉酶(AMY)、脂肪酶(LPS)和C反应蛋白(CRP)等]，尚无单一的诊断指标。目前评估AP病情严重程度主要依靠评分系统(如急性生理和慢性健康评估APACHE Ⅱ评分和Ranson评分)等方法[2]。但均具有一定的局限性。因此，迫切需要一种简便、特异的AP诊断生物学标志物。研究证实，miRNA与AP的发生、发展密切相关[3]，另有学者发现，AP大鼠或小鼠血清/血浆中miR-216a水平明显上调[4]，AP患者的血清/血浆中 miR-216a 水平也明显升高[5]。然而，miR-216a与AP疾病严重程度和病情变化的关系仍不清楚。因此，本研究旨在对不同严重程度及治疗前后AP患者血清miR-216a的表达水平进行分析，以期为AP的诊断、预后监测提供新的实验依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2016年1月至2017年1月在南京大学医学院附属金陵医院(南京总医院)消化内科和普外科就诊的AP患者160例，男 110例，女50例，年龄 18 ～ 87岁，中位年龄46 岁。AP诊断标准参考中华医学会制定的《急性胰腺炎诊治指南(2014)》[6]；临床上符合以下3项特征中的2项，即可诊断为AP：(1)与AP相符合的腹痛；(2)血清AMY酶和(或)LPS活性至少高于参考值上限3倍；(3)腹部影像学检查符合AP影像学改变。纳入标准：(1)符合AP诊断；(2)患者入院之前未经任何治疗，且于发病48 h内来我院就诊者；排除标准：年龄<18周岁，患有恶性肿瘤，HIV感染，乙肝，自身免疫性疾病，妊娠，糖尿病，慢性胰腺炎等。根据APACHE Ⅱ评分≥8或Ranson评分≥3，存在持续性器官衰竭及局部或全身并发症者作为重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP) 80例，男51例，女29例，年龄18～87岁，中位年龄48.5岁。根据APACHE Ⅱ评分<8且Ranson评分<3，无器官衰竭及局部或全身并发症者作为轻症急性胰腺炎(mild acute pancreatitis, MAP) 80例，男59例，女21例，年龄18～76岁，中位年龄41.5岁。选择同期体检健康者74例为健康人对照组，男46例，女28例，年龄28～74岁，中位年龄44.5岁。

1.2 主要仪器及试剂 WH-851型涡旋仪(太仓市华利达实验设备公司)；1612-1型高速离心机(上海医疗器械公司)；高速冷冻离心机(Eppendorf公司)；SAS67120型超纯水机(Millipore公司)；7300型PCR仪(美国ABI公司)；VITROS 5600全自动生化免疫分析仪(美国强生公司)；BC-5390 CRP 全自动血液细胞分析仪(迈瑞公司)；XN2000 全自动血细胞分析仪(日本Sysmex公司)；NanoDrop(美国Thermo Fisher科技公司)；miRNA测定用TaqMan探针(美国ABI公司)；酸性水饱和酚(索莱宝公司)；分析纯级氯仿、异丙醇、无水乙醇(上海化学试剂公司)；DEPC处理的ddH2O(美国Sigma公司)；miRNA逆转录试剂盒、qRT-PCR检测试剂盒(大连TaKaRa公司)；人工合成的miRNA成熟体(Invitrogen公司)；AMY、LPS、Ca2+、葡萄糖(Glu)、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)检测试剂盒(美国强生公司)；C反应蛋白(CRP)检测试剂(迈瑞公司)。

1.3 标本采集 采用真空采血促凝管收集健康人对照(禁食12 h以上)和AP患者(入院时首次采集，后经2～8周治疗，病情好转者出院当日再次采血)的空腹静脉血液标本3.5 mL，均于室温、3 500 r/min离心5 min，收集血清，置-80 ℃保存。

1.4 临床指标检测 按照VITROS 5600全自动生化免疫分析仪及各自检测试剂盒说明书操作检测血清AMY、LPS、Ca2+、Glu、TC和TG的表达水平，其中AMY和LPS采用两点速率法，Ca2+测定采用砷化物比色法，Glu测定采用葡萄糖氧化酶法，TC测定采用胆固醇氧化酶法，TG测定采用终点法；红细胞比容(HCT)用XN2000 血细胞分析仪(温氏法)测定；CRP用BC-5390 CRP 全自动血液细胞分析仪(免疫散射比浊法)测定，结果均按照试剂盒提供的参考范围判定。

1.5 血清RNA提取及逆转录反应 血清RNA采用酸性苯酚-氯仿一步抽提法进行[7]，RNA提取后溶于20 μL DEPC处理的ddH2O中，分别检测吸光度A260 nm和A260/280 nm计算RNA的浓度和纯度(A260/280 nm值为1.8～2.0认为纯度较好，用于后续实验)。按照miRNA逆转录试剂盒说明书操作将RNA逆转录为cDNA，样本置-20 ℃保存。

1.6 实时荧光定量PCR 采用基于Taqman探针的qRT-PCR法检测，引物及探针由美国ABI公司设计并合成。qRT-PCR总反应体系为20 μL，包括ddH2O 14.77 μL，10×PCR 缓冲液2 μL，25 mmol/L MgCl21.2 μL，10 mmol/L dNTPs 0.4 μL，rTaq酶0.3 μL，相应miRNA探针(miR-216a：MIMAT0000273, miR2911：MI0012634)0.33 μL，cDNA 1 μL。qRT-PCR循环参数：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40个循环。于60 ℃时用7300 system software软件采集荧光信号，以MIR2911作为外参照。阴性对照的样本为DEPC处理的ddH2O(不含cDNA模板)。结果采用2-ΔCt法计算，公式：ΔCt=Ct目的miRNA-CtMIR2911。实验设3个复孔，重复3次，结果取平均值。

2 结果

2.1 各组临床资料及相关指标检测结果 与健康人对照组相比，AP患者血液中Glu和TG水平明显升高(P<0.01)，HCT明显降低(P<0.01)。进一步进行亚组间的分析结果表明，与MAP患者相比，SAP患者CRP、Glu表达水平以及APACHⅡ评分和Ranson评分明显升高(P<0.01)；而Ca2+和HCT的表达水平明显降低(P<0.01)。见表1。

表1 AP患者与健康人对照组的临床基本资料比较

注：*，数据在分析之前已进行对数转换；与健康人对照组比较，△，P<0.05；与MAP组比较，#，P<0.05。

2.2 各组血清miR-216a检测结果 qRT-PCR检测结果显示，与健康人对照组[(11.12×10-5(5.83×10-5，19.12×10-5)]相比，AP患者血清miR-216a水平 [38.49×10-5(24.05×10-5，62.02×10-5)]明显升高，差异有统计学意义(U=-9.10，P<0.01)。进一步进行亚组间比较发现，MAP与SAP患者血清miR-216a水平[分别为36.46×10-5(22.29×10-5，55.80×10-5)，40.44×10-5(25.84×10-5，65.48×10-5)],差异无统计学意义(U=-0.96，P>0.05)。

2.3 ROC曲线分析 以AP患者作为疾病组，健康人作为对照组， miR-216a用于鉴别AP患者的ROC曲线下面积(AUCROC)为0.870(95%CI:0.825～0.915)，cut-off值为0.61，敏感性66%，特异性95%。以MAP患者作为疾病组，健康人作为对照组，其AUCROC为0.865(95%CI:0.808～0.921)，cut-off值为0.59，敏感性75%，特异性84%。以SAP患者作为疾病组，健康人作为对照组，其AUCROC为0.876 (95%CI:0.822～0.930)，cut-off值为0.66，敏感性71%，特异性95%。见图1。

图1 miR-216a鉴别AP、MAP和SAP患者与健康人对照的ROC曲线

2.4 AP患者治疗前后miR-216a的水平 进一步比较71例AP患者治疗前后血清中miR-216a水平的变化，结果显示，经治疗后，AP患者血清miR-216a的表达水平由[41.88×10-5(24.24×10-5，64.44×10-5)]下调至[20.58×10-5(11.01×10-5，41.91×10-5)]，差异有统计学意义(U=5.24，P<0.01)。

2.5 血清miR-216a的水平与其他检测指标相关性分析 结果显示，miR-216a与CRP呈正相关(r=0.215，P=0.006)，而与AMY(r=-0.011，P=0.889)，LPS(r=0.040，P=0.618),Glu(r=0.105，P=0.191),HCT(r=0.007，P=0.932)，Ca2+(r=-0.111，P=0.164)，TG(r=0.132，P=0.099)和TC(r=0.036，P=0.652)均无相关性。

3 讨论

血清中含有大量源自不同组织和器官的循环miRNAs，具有取材方便，稳定可靠等特点，已成为多种疾病的生物学标志物[8]。本实验采用qRT-PCR技术对不同严重程度的AP患者血清中的miR-216a表达水平进行检测，并观察了AP患者治疗好转后miR-216a的水平变化情况，同时，结合患者的临床资料进行综合分析，结果发现，MAP和SAP患者血清中miR-216a的表达水平明显升高，且患者病情好转，炎症指标基本恢复正常，胰周渗出较前有所减轻，无腹痛腹胀等不适后，其表达水平亦明显下降。ROC曲线分析显示，血清miR-216a对健康人对照组和AP患者，MAP患者及SAP患者均具有一定的鉴别意义。AP患者血清miR-216a水平的升高可能是由于其胰腺细胞损伤，促进该细胞主动或被动释放miR-216a到血液中，但其机制有待进一步研究。本研究结果显示，血清miR-216a水平不仅可较好的区分健康人和AP患者，甚至对症状较轻的MAP患者也具有较好的区分能力，由此可见， miR-216a可以反映胰腺的损伤，可作为AP潜在的诊断标志物。本研究结果还显示，当患者病情好转后，其血清miR-216a的水平趋于正常，可辅助反映患者的病情变化；提示miR-216a可能参与AP病理过程的发生、发展。目前AP的发病机制仍不清楚，广为接受的假说是，胰腺腺泡细胞内胰酶的过早激活，导致胰腺的自我消化并伴随着白细胞的浸润与活化[9]。Zhang等[10]研究发现，AP小鼠AR42J细胞中TGF-β 诱导miR-216a表达升高，miR-216a靶向作用于PTEN和Smad7蛋白，使其表达降低，从而激活PI3K/Akt信号通路，促进AP的进展。miR-216a是否还靶向其他关键蛋白质，参与调节胰腺炎的病理机制，将是我们今后研究的方向。本研究通过相关性分析发现，CRP与miR-216a呈正相关，提示miR-216a可能与炎症相关。由此可见，miR-216a可能参与AP的病理生理过程。

本研究初步探索了AP患者血清miR-216a水平与治疗前后病情变化的关系，但仍在不足之处：首先样本量有限，尚需要大样本量的验证。而miR-216a在胰腺炎发生中的异常表达，提示其可能对胰腺炎的进展发挥重要作用，需要对其作用机制深入研究。除此之外，应增加对病情恶化的SAP患者的观察，动态追踪miR-216a的变化，以期为临床提供准确的预后监测指标。

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(本文编辑：许晓蒙)

Clinical significance of serum miR-216a in diagnosis and prognosis monitoring of patients with acute pancreatitis

LUPan,SONGJia-xi,WANGFeng,YANJing,WANShu-jun,WANGJun-jun

(DepartmentofClinicalLaboratoryMedicine,JinlingHospital,MedicalSchoolofNanjingUniversity，Nanjing210002,Jiangsu,China)

Objective To detect altered levels and clinical significance of serum miR-216a and prognosis monitoring in acute pancreatitis (AP) patients. Methods Serum miR-216a levels were determined by quantitative reverse-transcription PCR (qRT-PCR) assay among 80 mild acute pancreatitis (MAP) patients, 80 severe acute pancreatitis (SAP) patients and 74 healthy controls. And amylase (AMY), lipase (LPS), Ca2+, glucose (Glu), hematocrit (HCT), triglyceride (TG), total cholesterol (TC) and C reactive protein (CRP) were measured by biochemical analyzer. The clinical usefulness of miR-216a for AP patients was assessed by ROC curve analysis and correlation analysis. Results Compared with healthy controls (11.12×10-5[5.83×10-5，19.12×10-5], the serum miR-216a levels were significantly increased in AP patients(38.49×10-5[24.05×10-5，62.02×10-5], (U=-9.10，P<0.01)。The serum miR-216a levels in MAP and SAP patients were (36.46×10-5[22.29×10-5，55.80×10-5]vs 40.44×10-5[25.84×10-5，65.48×10-5])，there was no significant difference between MAP and SAP patients(U=-0.96,P>0.05). The areas under ROC curve (AUCROC) of miR-216a for differential healthy controls and AP patients was 0.870 (95%CI:0.825-0.915), cut-off value is 0.61. AUCROCof miR-216a for differential healthy controls and MAP patients was 0.865 (95%CI: 0.808-0.921), cut-off value is 0.59. And AUCROCof miR-216a for differential healthy controls and SAP patients was 0.876 (95%CI:0.822-0.930), cut-off value is 0.66. Moreover, after the clinical improvement of the patients, the levels of serum miR-216a were significantly lowered from (41.88×10-5[24.24×10-5，64.44×10-5]) to (20.58×10-5[11.01×10-5，41.91×10-5]), the differences was significant(U=5.24，P<0.01). Correlation analysis showed that miR-216a was positively correlated with CRP (r=0.215,P=0.006) in AP patients. Conclusion The levels of miR-216a in serum of AP patients were increased, which is a potential biomarker for the diagnosis and prognosis monitoring of AP.

acute pancreatitis; miR-216a; biomarkers; prognosis monitoring

10.13602/j.cnki.jcls.2017.08.05

国家自然科学基金(81572073；81572074)。

陆攀，1991年生，女，硕士研究生，研究方向：疾病分子标志物的基础和临床研究。

汪俊军，主任技师，教授，博士，E-mail:wangjj9202@163.com。

R657.5+1

A

2017-06-02)