Keap1与食管鳞状上皮细胞癌淋巴结转移和浸润深度的关系

马兰英，王华，唐勇

(1.新疆医科大学附属肿瘤医院消化内科，乌鲁木齐 830000；2.新疆医科大学基础医学院，乌鲁木齐 830000)

·临床实验研究·

Keap1与食管鳞状上皮细胞癌淋巴结转移和浸润深度的关系

马兰英1，王华2，唐勇1

(1.新疆医科大学附属肿瘤医院消化内科，乌鲁木齐 830000；2.新疆医科大学基础医学院，乌鲁木齐 830000)

目的 分析Keleh样环氧氯丙烷相关蛋白1(Keleh-like ECH-associated protein 1，Keap1)的表达水平与食管鳞状上皮细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)淋巴结转移和浸润深度的关系。方法 采用免疫组化SP法检测ESCC患者的癌组织和癌旁组织中Keap1的表达水平，通过单因素和多因素分析及趋势χ2检验分析其与ESCC淋巴结转移和浸润深度的关系。结果 Keap1高表达与淋巴结转移(OR=3.945，95%CI：1.485～9.147)和浸润深度(OR=4.683，95%CI：1.692～10.275)有关；Keap1高表达是ESCC淋巴结转移的危险因素(Waldχ2=23.579，P<0.01)，趋势χ2检验结果显示，ESCC患者淋巴结转移的风险随Keap1表达水平的升高而升高(χ2=5.173，P=0.023)；Keap1的表达是ESCC侵及浆膜的危险因素(Waldχ2=26.587，P<0.01)，趋势χ2检验结果显示，ESCC侵及浆膜的风险随Keap1表达水平的升高而升高(χ2=9.788，P=0.002)。结论 Keap1的表达与ESCC的发生、发展有关，Keap1的表达可促进ESCC的淋巴结转移和浸润。

Keleh样环氧氯丙烷相关蛋白1；食管鳞状上皮细胞癌；淋巴结转移；浸润深度；单因素分析；多因素分析；趋势χ2检验

Keap1-Nrf2-ARE信号通路是机体抗氧化应激和损伤的重要调节通路，能够诱导机体的内源性抗氧化应答，其主要由Keleh样环氧氯丙烷相关蛋白1(Keleh-like ECH-associated protein 1，Keap1) 和核转录因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)等组成[1]。研究显示，Keap1在肺癌、前列腺癌、胃癌、喉癌、卵巢癌和食管鳞状上皮细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)等组织中的表达存在异常，提示其可能与肿瘤的发生、发展有关[2-5]。针对ESCC的研究显示，Keap1在癌组织中的阳性率明显高于正常食管黏膜组织[5]。基于此，本研究拟检测ESCC癌组织和癌旁组织中Keap1的表达水平，明确其与ESCC患者临床病理参数之间的相关性，并进一步分析其与ESCC淋巴结转移和浸润深度的关系，以期探讨Keap1在ESCC发生、发展过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 研究对象 以2011年3月至2016年3月于新疆医科大学附属肿瘤医院手术切除且临床资料完备的196例ESCC患者为研究对象，男104例，女92例，年龄34～76岁，中位年龄60岁，均来自新疆及周边地区；纳入标准：(1)经组织病理学检查确诊的ESCC初治患者；(2)均进行手术切除；(3)手术切除前均未进行放、化疗；(4)临床资料完整。排除标准：(1)合并第2原发癌的患者；(2)患有乙肝、丙肝和梅毒等传染病的患者；(3)因其他原因存在肝功损害的患者；(4)不同意参加本研究的患者。其中有淋巴结转移者113例，无淋巴结转移者83例；高中分化鳞状上皮细胞癌156例，低分化鳞状上皮细胞癌40例。采集各研究对象的癌组织，并随机选取31例患者的癌旁食管组织(距离癌组织5 cm以上,且经病理组织学证实无癌细胞)为对照组，男16例，女15例，年龄34～74岁，中位年龄59岁；其中有淋巴结转移者19例，无淋巴结转移者12例；高中分化鳞状上皮细胞癌25例，低分化鳞状上皮细胞癌6例。本研究经医院医学伦理学委员会批准，患者知情同意。

1.2 主要试剂和仪器 兔抗人Keap1多克隆抗体(BA4479-1，武汉博士德公司)，通用型SP试剂盒(PV-9000)和DAB显色剂(ZLI-9018)购自北京中杉金桥公司，BX46光学显微镜(日本Olympus公司)。

1.3 免疫组化SP法检测 ESCC癌组织标本和癌旁组织标本用10%甲醛固定，常规石蜡包埋，以4 μm的厚度切片。石蜡切片于60 ℃恒温箱中烘烤20 min，用二甲苯浸泡25 min进行脱蜡；无水乙醇脱水各2 min， 95%、80%、70%乙醇脱水各2 min；抗原修复后加入过氧化氢(H2O2)封闭内源性过氧化氢酶；加入兔抗人Keap1多克隆抗体(1∶100稀释)室温静置1 h；DAB显色液显色5～10 min，苏木精复染2 min，常规脱水、透明、封片和镜检。以PBS代替一抗作为阴性对照，以出现淡黄色或棕黄色反应判断为阳性。染色结果的判定采用双盲法，由2位病理科医师分别进行阅片。Keap1抗原阳性反应定位于细胞质内。随机选取5个高倍镜视野(×200)，每个视野分别记数200个细胞，共计数1 000个。阳性结果的判定参照Li等[6]的评判标准，按染色强度分为：0分，无染色；1分，染色呈淡黄色；2分，染色呈棕黄色；3分，染色呈棕褐色；阳性细胞比例<5%记为0分，5%～25%记为1分，26%～50%记为2分，51%～75%记为3分，>76%记为4分，按照染色强度和阳性细胞比例乘积判定免疫组织化学表达水平。接Keap1蛋白的表达水平分为：Keap1高表达组(5～12分)和Keap1低表达组(0～4分)。

1.4 统计学分析 采用SPSS 17.0统计软件进行。单因素分析采用χ2检验或t检验，多因素分析采用Logistic回归分析，表达水平与淋巴结转移和浸润深度之间的关系采用趋势χ2检验。以P<0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 ESCC患者癌组织和癌旁组织中Keap1的表达水平 196例ESCC患者癌组织中140例表达Keap1蛋白(阳性率71.4%)，31例癌旁组织中5例表达Keap1蛋白(阳性率16.1%)，两组间差异有统计学意义(χ2=35.474，P<0.01)。

2.2 Keap1的表达水平与ESCC患者临床病理参数之间的关系 单因素分析显示，年龄、肿瘤大小、淋巴结转移、分化程度和浸润深度在Keap1高表达组与Keap1低表达组间的差异均具有统计学意义(表1)。多因素分析显示，Keap1的高表达与淋巴结转移和浸润深度有关，与年龄、肿瘤大小和分化程度无关(表2)。

2.3 Keap1的表达水平对淋巴结转移的影响 Logistic回归分析显示，调整年龄、性别、肿瘤大小、TNM分期、分化程度、浸润深度和肿瘤部位后，Keap1表达是ESCC淋巴结转移的危险因素(表3)。趋势χ2检验显示，ESCC患者淋巴结转移的风险随Keap1的表达水平的升高而升高(χ2=5.173，P=0.023)。

2.4 Keap1的表达水平对浸润深度的影响 Logistic回归分析显示，调整年龄、性别、肿瘤大小、TNM分期、分化程度、淋巴结转移和肿瘤部位后，Keap1表达是ESCC侵及浆膜的危险因素(表4)。趋势χ2检验显示，ESCC侵及浆膜的风险随Keap1的表达水平的升高而升高(χ2=9.788，P=0.002)。

表1 Keap1表达水平与ESCC患者临床病理参数的单因素分析结果

参数Keap1高表达(n=87)Keap1低表达(n=109)t/χ2P性别 男48560．2800．597 女3953年龄(岁)61．8±8．753．2±7．67．324<0．01肿瘤大小(cm)6．25±2．144．18±1．867．138<0．01TNM分期 Ⅰ、Ⅱ期37540．9570．328 Ⅲ、Ⅳ期5055分化程度 高、中分化76805．8060．016 低分化1129浸润深度 未侵及浆膜175823．220<0．01 侵及浆膜7051淋巴结转移 无186518．694<0．01 有5954肿瘤部位 食管上段1923 食管中段38470．0390．981 食管下段3039

3 讨论

Keap1可通过与Nrf2的结合来抑制Nrf2的活性[7]。正常情况下，机体内的Keap1处于“关闭”状态，可使Nrf2泛素化而被降解，从而减少胞质中的Nrf2向核内转移[8]。致瘤因素的刺激和氧自由基(reactive oxygen species，ROS)的攻击可使Keap1的部分结构被修改，导致Nrf2结合部位的构象改变，从而引起Nrf2与其解离，转移至细胞核内，并与解毒Ⅱ相酶启动子区域的抗氧化反应元件(antioxidant response element，ARE) 结合[9]。Nrf2与ARE结合后可以调控下游产物的表达，包括血红素加氧酶1(hemeoxygenase-1，HO-1)、谷胱甘肽S转移酶(glutathione S-transferase，GSTs)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)等具有抗炎、抗氧化作用的蛋白质和酶，从而保护机体免受致病因素的损伤。机体恢复平衡后，Keap1又会回到“关闭”状态，使细胞核内/外的Nrf2恢复到原来的水平，维持细胞的氧化还原稳态。由此可见，Keap1是Keap1-Nrf2-ARE信号通路激活的“分子开关”，但Keap1易发生突变，失去对Nrf2 的负性调节，从而导致Nrf2的核定位、表达上调及下游基因的转录激活，同时Nrf2 在细胞核中的累积是肿瘤获得耐药性的重要原因之一。因此，Keap1-Nrf2-ARE信号通路具有双重性。

白美玲等[5]的研究显示，Keap1在ESCC组织中的阳性率明显高于正常的食管组织；杨海虹等[7]的研究显示，晚期非小细胞肺癌患者癌组织中Keap1 mRNA的表达明显升高。本研究结果表明，ESCC组织中Keap1的表达率明显高于癌旁食管组织，与白美玲等[5]的研究结果类似，说明Keap1的表达与ESCC的发生、发展有关。推测其机制可能与高表达的Keap1抑制Nrf2的活化有关。通过进一步分析癌组织中Keap1的表达水平，本研究还发现Keap1的表达是ESCC淋巴结转移和侵及浆膜的危险因素，且ESCC淋巴结转移和侵及浆膜与Keap1的表达水平之间存在剂量-反应关系。进一步证实Keap1的表达与ESCC的发生、发展有关，Keap1的表达可促进ESCC的淋巴结转移和浸润。

本研究的不足之处主要在于没有检测癌组织中Nrf2的表达，因此无法明确解释Keap1促进ESCC的发生、发展的机制，此外，本研究人群主要来源于新疆及周边地区，但并未对不同民族进行分类检测。在下一步的工作中，我们将对Keap1-Nrf2-ARE信号通路与ESCC发生、发展之间的关系进行深入的研究，并纳入民族、地域分布等因素，明确该信号通路在ESCC发生、发展中的作用及其机制。

表2 ESCC患者癌组织中Keap1表达水平的多因素分析结果

表3 Keap1的表达与ESCC淋巴结转移的危险因素分析

表4 Keap1的表达与ESCC侵及浆膜的危险因素分析

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(本文编辑：许晓蒙)

10.13602/j.cnki.jcls.2017.08.16

马兰英，1983年生，女， 主治医师，硕士，主要从事消化系统肿瘤研究。

唐勇，主任医师，E-mail：mly801021@126.com。

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2017-04-17)