外周血CD4/CD8 双阳性T细胞在类风湿性关节炎中的表达及意义*

徐学静，高硕，胡伟，王向阳，陈军浩，王森

(南京大学医学院附属鼓楼医院检验科，南京 210008)

·临床实验研究·

外周血CD4/CD8 双阳性T细胞在类风湿性关节炎中的表达及意义*

徐学静，高硕，胡伟，王向阳，陈军浩，王森

(南京大学医学院附属鼓楼医院检验科，南京 210008)

目的 分析类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis, RA)患者外周血CD4/CD8双阳性T细胞(double positive T cells, DPT)的表达水平及功能，并探讨DPT在RA发病中的作用。方法 通过流式细胞术检测25例RA患者及25例健康人对照外周血CD3+细胞中CD4+/CD8+双阳性细胞的比例；ELISA法检测RA患者及健康人对照血清中抗环瓜氨酸肽抗体(ACCP)、IL-6、TNF-α、IFN-γ和IL-12的表达水平，全自动生化分析仪检测C反应蛋白(CRP)、类风湿因子(RF)。结果 与健康人对照组相比，RA患者组DPT占CD3+T细胞的比例明显升高，两组间差异具有统计学意义(t=4.63,P<0.01)；RA患者组的ESR、CRP、RF、ACCP、IL-6和TNF-α水平均高于健康人对照组，差异有统计学意义(t分别为3.71，2.99，8.42，4.25， 2.12，3.23；P分别为0.000 5，0.004 3，0.01，0.01，0.039，0.002 3)。DPT的表达水平与RA患者的年龄，ACCP，RF及血清中IFN-γ、TNF-α、IL-12的水平不相关，而与患者ESR，CRP，IL-6水平呈正相关(r分别为0.65，0.4，0.46；P分别为0.000 4，0.04，0.02)。结论 RA患者外周血DPT表达水平明显升高，在RA发病及进展中发挥重要作用。

类风湿性关节炎；T细胞亚群；CD4/CD8双阳性T细胞

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以关节及关节滑膜损伤为主的自身免疫性疾病，其确切的发病机制仍不完全清楚，但与细胞免疫功能紊乱、T细胞异常活化及T细胞亚群的失衡等因素有关[1-3]。近年来的研究表明，在人及其他哺乳动物的胸腺外的免疫组织及器官中出现CD4/CD8双阳性细胞(double positive T cells,DPT)[4]。外周血DPT在T淋巴细胞中的比例一般低于2%，在自身免疫性疾病(如系统性硬化)及病毒感染(如HIV感染)等过程中DPT表达水平上升，并表达IFN-γ及IL-6等细胞因子，参与T细胞的活化[5-6]。目前DPT在RA中的表达及意义仍不明确。本研究通过流式细胞术检测RA患者外周血中DPT的表达水平，分析DPT与RA患者临床指标的关系，旨在探讨DPT在RA发病机制中的作用及临床意义。

1 材料与方法

1.1 研究对象 收集2017年2-5月就诊于南京大学医学院附属鼓楼医院风湿免疫科的RA患者25例，男5例，女20例，中位年龄52.4岁，诊断均符合2010年美国风湿病学学会/欧洲抗风湿病联盟(ACR/EULAR)的RA诊断标准，所有RA患者均使用过糖皮质激素、非甾体类抗炎药等抗风湿药。排除标准：对患严重的肝肾疾病，血液系统疾病，恶性肿瘤，自身免疫性疾病以及近期有手术、外伤和严重感染的患者予以排除。收集同期就诊的体检健康者25例，男19例，女6例，中位年龄51.2岁。本研究经医院医学伦理学委员会批准，患者知情同意。

1.2 试剂及仪器 鼠抗人CD3/CD4/CD8流式抗体、红细胞裂解液、TNF-α/IL-6/IFN-γ/IL-12 ELISA试剂盒(美国BD公司)；抗环瓜氨酸肽抗体(ACCP) ELISA检测试剂盒(上海科新公司)；血沉仪(意大利Vital diagnostincs公司)；全自动生化分析仪(德国Beckman公司)，酶联仪(美国Bio-Rad公司)，流式细胞仪(美国BD公司)。

1.3 标本采集 RA患者(于入院时)与健康人对照(于体检时)分别空腹抽取2 mL静脉血EDTA-K2抗凝， 2 mL静脉血于枸橼酸钠血沉管，另取5 mL 静脉血于含有分离胶和促凝剂的采血管中。EDTA-K2抗凝血及时进行流式检测；枸橼酸钠抗凝血及时进行血沉检测；促凝血离心取上清后置-80 ℃冻存，待标本收集完成后统一检测。

1.4 CD3/CD4/CD8的流式染色 取CD3、CD4、CD8流式抗体各5 μL加至流式管管底，将各患者及健康人对照EDTA-K2抗凝血颠倒混匀，用加样器取50 μL加至流式管中。震荡混匀后室温避光温育15 min，加入红细胞裂解液1 mL，室温避光裂解5 min，加入3 mL PBS，1 500 r/min离心5 min,洗涤2次后流式上机进行检测。使用BD Cellquest软件获取数据，在前向散射光(FSC)及侧向散射光(SSC)点图上大致圈选出淋巴细胞，然后使用CD3设门，进一步在CD3+细胞中分析PPT所占的比例。流式数据分析及作图使用Flowjo软件(美国Tree star公司)。

1.5 ELISA法检测血清学指标

1.5.1 ELISA法检测患者血清中ACCP水平 采用ELISA法检测血清ACCP，具体步骤和方法严格按照试剂盒说明书操作。以ACCP浓度<25 RU/mL时判为阴性。

1.5.2 ELISA法检测血清中TNF-α、IL-6、IFN-γ、IL-12水平 使用包被缓冲液按1:250的比例稀释包被抗体，计算所需孔数，在包被板中每孔加入100 μL 包被液，4 ℃温育过夜。弃去包被液，每孔加入300 μL PBST洗涤3次，每孔加入200 μL样本稀释液，室温封闭1 h。准备待测样本及标准品，按说明书溶解及稀释标准品。弃去封闭液，洗涤3次后每孔加入100 μL样本、标准品及阴性对照，封板并室温温育2 h。洗涤5次后每孔加入100 μL的含抗体及HRP的工作液，室温温育1 h。弃去工作液，洗涤7次后，每孔加入100 μL显色液，室温避光温育15 min，观察显色情况，每孔加入100 μL终止液。用酶联仪，检测波长450 nm时的吸光度(A450 nm)值。绘制标准曲线并计算各样本浓度。

2 结果

2.1 各组外周血DPT的表达水平 RA组DPT占CD3+T细胞的比例(%)为2.55±0.27，健康人对照组为1.20±0.09，两组间差异有统计学意义(t=4.63,P<0.01)。RA患者及健康人对照DPT的流式细胞结果见图1。

2.2 各组临床指标及细胞因子的表达水平 RA患者及健康人对照组间年龄及IFN-γ、IL-12表达水平的差异无统计学意义(P>0.05)；而RA患者组的ESR、CRP、RF、ACCP、IL-6、TNF-α水平均高于健康人对照组，差异有统计学意义(P均<0.05)。见表1。

2.3 RA患者DPT表达与各指标相关性分析 RA患者DPT的表达水平与ESR(r=0.65,P=0.000 4)，CRP(r=0.4,P=0.04)，IL-6(r=0.46,P=0.02)之间存在明显的相关性，而与年龄(r=0.17,P=0.36), RF(r=0.16,P=0.44), ACCP(r=0.04,P=0.8), TNF-α(r=0.03,P=0.86),IFN-γ(r=0.17,P=0.38), IL-12(r=0.05,P=0.77)间均无明显相关性。

图1 RA患者(A)及健康人对照(B)DPT检测的流式细胞分析

项目RA组(n=25)健康人对照组(n=25)tP年龄(岁)52．44±2．1451．20±1．930．430．67ESR(mm/h)35．56±6．2211．32±2．033．710．0005CRP(mg/L)22．94±6．892．30±0．242．990．0043RF(IU/mL)51．00±5．365．42±0．798．420．01ACCP(RU/mL)384．70±82．4732．63±7．634．250．01IL⁃6(pg/mL)58．95±10．4334．88±4．512．120．039TNF⁃α(pg/mL)143．20±13．7191．06±6．563．230．0023IFN⁃γ(pg/mL)224．90±40．51136．50±13．261．970．056IL⁃12(pg/mL)81．69±10．1461．44±3．941．830．073

3 讨论

T细胞的异常激活一直被认为是RA发病及进展的关键。不同亚群的T细胞在RA发病中发挥不同的作用，以往多数研究关注TH1,TH17,Treg等T细胞亚群。近年来的研究表明，在某些疾病中DPT的表达水平上升，并可参与T细胞的活化[5, 7-8]。本研究检测了RA患者外周血中PPT的水平，发现与健康人对照相比，PPT明显升高，其表达水平与年龄、ACCP、RF无明显相关性，而与ESR、CRP有明显相关性。分析PPT水平与血清细胞因子的关系发现，其表达水平与IFN-γ、TNF-α、IL-12的含量无明显相关性，但与IL-6存在明显的相关性。

研究表明，在某些自身免疫性疾病中外周血DPT的比例升高，如多发性硬化患者外周DPT明显高于健康人对照及其他自身免疫性疾病，经过激素治疗后的患者DPT水平下降，表明DPT可能参与多发性硬化病程中的免疫紊乱[6]。目前DPT在RA中的表达及临床意义尚不明确，为此，本研究检测了DPT的表达水平并分析其与临床指标及细胞因子的相关性，结果表明，DPT占CD3+T细胞的比例明显高于健康人对照。年龄因素往往会影响一些细胞亚群的比例，而本研究中DPT的比例与年龄不相关，表明DPT的水平不受年龄因素的影响。ACCP及RF是诊断RA的重要临床指标，本研究中DPT的比例与ACCP及RF水平无相关性。但与ESR及CRP明显相关，ESR及CRP是评估自身免疫性疾病活动性的重要指标，提示DPT可能与疾病的活动及进程相关。自身免疫性疾病往往伴随外周血中细胞因子的异常表达，研究表明，RA患者血清中IFN-γ、TNF-α、IL-6等细胞因子的表达水平升高[9-11]。本研究检测了RA患者血清中多种细胞因子的含量并分析与DPT的相关性，结果表明DPT与IL-6含量呈明显的正相关；推测原因，DPT可能通过产生过量IL-6在RA致病中发挥重要作用。本研究尚存在一些不足，如由于纳入的病例数量有限，RA患者均接受过抗炎治疗，无法比较患者治疗前后DPT的差异；此外，本研究仅检测了IL-6、TNF-α等4种细胞因子，下一步的研究我们将扩大病例数量，比较治疗前后DPT的差异并探索不同细胞因子与DPT表达的关系及相关机制。

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(本文编辑：许晓蒙)

10.13602/j.cnki.jcls.2017.08.14

国家自然基金青年基金(81601765)。

徐学静，1983年生，女，主管技师，硕士，主要从事免疫学研究。

王森，主管技师，博士，E-mail:slzw1985@163.com。

R593.22

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2017-06-01)