参附注射液对心力衰竭大鼠氧化应激及细胞凋亡的影响*

邓 萌 郭 丽张 丽

（佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154002）

·实验报告·

参附注射液对心力衰竭大鼠氧化应激及细胞凋亡的影响*

邓 萌 郭 丽△张 丽

（佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154002）

目的 观察参附注射液对心力衰竭大鼠氧化应激及细胞凋亡的影响并探讨其机制。方法 将36只SD大鼠随机分为假手术组（12只）、心衰模型组（12只）、参附治疗组（12只），术后第4周开始给予参附治疗组每日1次灌胃给药［日剂量6.0 mL/（kg·d）］，共4周。观察评定左室舒张末径（LVDS）、室收缩末径（LVDd）、左室射血分数（LVEF）、短轴缩短率（FS）、血流动力学指标心率（HR）、左心室收缩压（LVSP）、左室舒张末期压（LVEDP）、左心室压变化速率最大值、心肌超氧化物歧化酶（SOD）含量、心肌丙二醛（MAD）含量及心肌目的蛋白质等的变化。结果 与假手术组比较，模型组LVDd、LVDS明显增大，LVEF、FS明显下降，BNP水平明显升高（均P<0.05）；参附注射液治疗后与模型组比较，各指标均改善（均P<0.05）。与假手术组比较，模型组LVEDP明显增大，LVSP下降，+dp/dtmax、-dp/dtmax、HR明显下降（均P<0.01）；参附注射液治疗后与模型组比较，各指标均改善（均P<0.01）。与假手术组比较，心衰模型组心肌SOD活性明显降低（P<0.01），给予参附注射液处理后，心肌SOD活性明显高于心衰模型组（P<0.01）；心衰模型组 MDA含量明显高于假手术组（P< 0.01），参附注射液处理后，MDA含量明显低于心衰模型组（P<0.01）。Bax蛋白表达明显降低，Bcl-2蛋白表达明显升高，Bax/Bcl-2的比值明显降低（P<0.01）。SOD与Bcl-2/Bax线性相关性具有统计学意义（r=0.652，P<0.001），存在线性正相关关系；MDA与Bcl-2/Bax线性具有统计学意义（r=-0.644，P<0.001），存在线性负相关关系。结论 参附注射液可降低氧化应激水平，抑制蛋白凋亡，从而改善心衰大鼠心功能，其机制可能与上调凋亡抑制蛋白Bcl-2，下调促凋亡蛋白Bax的表达有关。

心力衰竭 参附注射液 氧化应激 细胞凋亡

慢性心力衰竭（CHF）是各种心脏疾病的终末阶段，近年来发病率居高不下。其发病机制是近年来研究热点。而其药物干预治疗研究更为临床提供了理论依据。有研究显示，参附注射液可显著地将氧自由基去除、使脂质的过氧化水平受到限制、降低血小板聚集、扩张冠状动脉、使心肌细胞的耗氧量下降，并抑制大鼠心肌细胞凋亡、降低大鼠心肌细胞凋亡率，从而保护心肌［1-2］。参附注射液影响CHF的发生、发展的机制，目前尚未完全阐明，与一些相关危险因素的关系还存在着不同的看法，有待于进一步深入研究。本实验是通过测定心力衰竭大鼠氧化应激水平及细胞凋亡蛋白表达的变化，探讨心力衰竭发生时氧化应激水平与细胞凋亡之间的相关性，进而阐明参附在慢性心力衰竭演变过程中所表现的保护作用及其机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级SD大鼠36只，体质量180～220 g，由哈尔滨医科大学实验动物中心提供，许可证：SCXK（黑）2013-001。

1.2 实验仪器与试剂 UV751GD紫外/可见分光光度计（上海分析仪器厂）；参附注射液（四川雅安三九药业有限公司，50 mL/瓶，批号：Z2004-3117）；超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）试剂盒由南京建成生物工程研究所提供，兔抗Bax多克隆抗体、兔抗Bcl-2多克隆抗体为美国Santa Cniz公司产品，由武汉博士德公司提供。

1.3 造模与分组 大鼠实验前普通基础饲料喂养1周后，按随机数字表法分为假手术组12只、心衰模型组12只、参附治疗组12只。所有动物均常规喂养。心衰模型造模方法：采用腹主动脉缩窄法制备心脏压力负荷超载心衰模型，主要步骤如下，以10%水合氯醛（3 mg/kg）腹腔麻醉，备皮，常规强力碘消毒，逐层打开腹腔，左侧肾动脉上方游离腹主动脉长约1 cm，与腹主动脉平行放置7号钝针头，一同结扎后，肾出现缺血外观，抽出针头，使腹主动脉部分缩窄，狭窄处内径0.7 mm，关腹。大鼠术后均予青霉素10万U 3 d预防感染。大鼠术后普通饲料喂养8周。假手术组除开腹暴露、分离双侧肾动脉间腹主动脉但不行缩窄处理外，其余步骤与心衰模型组处理一致。参附治疗组造模后第4周开始每日1次，灌胃给药［日剂量6.0 mL/（kg·d）］，共4周。

1.4 观察指标 1）超声心动图检测：大鼠以10%水合氯醛3 mL/kg，腹腔注射麻醉后备皮，应用超声工作站测定左室收缩期内径（LVDS）、舒张期内径（LVDd）、左室射血分数（LVEF）和短轴缩短率（FS）。2）血流动力学指标检测：末次给药后24 h后，采用10%水合氯醛（3 mg/kg）进行腹腔注射麻醉。取大鼠颈前正中切口，经右颈总动脉插管至左心室，连接BL-420E+生物机能实验系统检测大鼠心功能。分别测定左心室收缩压（LVSP）、左心室舒张末压（LVEDP）以及左心室内压最大上升速率（+dp/dt max）及左心室内压最大下降速率（-dp/dt max）以及心率 （HR）。3）心肌SOD和心肌MDA含量测定：取心室部分，用0.9%氯化钠注射液制备心脏匀浆，1500 r/min，离心10 min，黄嘌呤氧化酶法测定心肌SOD含量，采用硫代巴比妥酸显色法测定心肌MDA含量。4）细胞凋亡检测：取出心脏，置冰上去除心耳心房，取左心室心尖部用于Western blotting检测，得出目的蛋白表达的相对光密度。

1.5 统计学处理 应用SPSS22.0统计软件。计量资料以（±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。实验数据中两种变量存在一定的相关性，使用Pearson线性相关性分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组超声心动指标比较 见表1。结果示，与假手术组比较，模型组LVDd、LVDS明显增大，LVEF、FS明显下降，BNP水平明显升高（均P<0.05）；参附注射液治疗后与模型组比较，各指标均改善（均P<0.05）。

表1 各组LVDd、LVDS、LVEF、FS、BNP指标比较（±s）

表1 各组LVDd、LVDS、LVEF、FS、BNP指标比较（±s）

与假手术组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

组 别 n LVDd（cm） LVDS（cm） LVEF（%）FS（%） BNP（pg/mL）术组 12心衰模型组 8 6.19±0.72 2.81±0.68 81.62±4.60 6.83±0.28*4.57±0.45*61.74±3.17*53.24±3.85 131.82±3.77 32.90±2.01*1088.39±199.21*参附治疗组 106.65±0.42△3.33±0.49△71.30±3.24△41.02±2.63△305.28±123.01△

2.2 各组血流动力学指标检测结果比较 见表2。结果示，与假手术组比较，模型组LVEDP明显增大，LVSP下降，+dp/dtmax、-dp/dtmax、HR明显下降（均P<0.01）；参附注射液治疗后与模型组比较，各指标均恢复（均P< 0.01）。

表2 各组LVEDP、LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax、HR指标比较（±s）

表2 各组LVEDP、LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax、HR指标比较（±s）

组 别 n LVEDP（mmHg）LVSP（mmHg）+dp/dtmax（mmHg/s）dp/dtmax（mmHg/s） HR（bpm）假手术组 12心衰模型组 8 7.07±0.27 144.51±3.76 4523.00±368.27 26.20±1.66**105.99±3.09**2615.38±382.93**3875.25±156.26384.75±3.25 2074.38±160.03**423.88±3.00**参附治疗组 1015.61±2.85△△123.65±5.59△△3625.30±365.49△△2968.5±172.94△△400.90±3.78△△

2.3 各组大鼠心肌SOD活性和MDA含量的影响及Bax、Bcl-2蛋白表达水平比较 见表3。结果示，与假手术组比较，心衰模型组心肌SOD活性明显降低（P< 0.01），给予参附注射液处理后，心肌SOD活性明显高于心衰模型组（P<0.01）；心衰模型组MDA含量明显高于假手术组（P<0.01），参附注射液处理后，MDA含量明显低于心衰模型组（P<0.01）。Bax蛋白表达明显降低，Bcl-2蛋白表达明显升高，Bax/Bcl-2的比值明显降低（P<0.01）。

表3 各组大鼠心肌SOD活性、MDA含量及、Bcl-2/Bax比较（±s）

表3 各组大鼠心肌SOD活性、MDA含量及、Bcl-2/Bax比较（±s）

组 别 n SOD（KU/L） MDA（μmol/mg） Bcl-2/Bax假手术组 12心衰模型组 8 140.37±7.84 4.48±1.26 1.58±0.20 80.89±6.65**15.99±2.44**0.45±0.65**参附治疗组 10108.95±6.64△△11.59±2.35△△1.14±0.52△△

图1 各组大鼠心肌细胞Bcl-2/Bax比值比较

2.4 Bcl-2/Bax与大鼠心肌SOD活性和MDA含量进行直线回归分析 结果示，SOD与Bcl-2/Bax线性相关性具有统计学意义（r=0.652，P<0.001），存在线性正相关关系；MDA与Bcl-2/Bax线性具有统计学意义（r= -0.644，P<0.001），存在线性负相关关系。

3 讨 论

CHF是各种因素引起的心肌损伤，进而引起心肌结构和功能改变，引发组织灌注量不足。CHF是各种心脏疾病的终末期表现，发病率近年来呈上升趋势，死亡率高，已引起临床高度关注［3-5］。

氧自由基可改变心脏结构、导致心脏功能异常，促进心衰的演变进程［6-7］。近年来研究表明，心衰动物模型中氧自由基显著增多，抵抗被氧化的能力降低。当氧自由基抵抗物质活性下降或产生过度，将导致氧自由基沉积，进而刺激细胞膜脂质发生过氧化反应。MDA是自由基刺激细胞膜发生过氧化反应的产物之一，SOD为代表的抗氧化酶系统可清除体内自由基。CHF发生发展过程中，心肌细胞减少或（和）剩余心肌收缩功能代偿不足导致心脏结构异常和功能改变，原因可能是细胞凋亡。研究表明，抑制凋亡蛋白Bcl-2与促凋亡蛋白Bax水平高低关乎凋亡调控；有证据显示受凋亡刺激后的细胞生存能力由Bcl-2/Bax决定，Bcl-2/Bax升高，提升细胞生存率，否则反之。

本实验发现心衰模型组心肌MDA、SOD、凋亡蛋白Bcl-2/Bax发生显著变化，与假手术组对照均有明显差异，说明氧化应激可导致心肌细胞的结构破坏和功能异常，心力衰竭演变进程中凋亡的程度明显升高。相关性分析显示由于氧化应激加速了心肌细胞凋亡的产生，进而引起心功能下降，导致心力衰竭。

CHF按其临床表现可归属于中医学 “心悸”“胸痹”“脱证”范畴，其病理基础为心气阴虚。虚标实证、心脾肾阳虚，其关键环节为瘀血、痰浊、水饮为标，血脉瘀滞。参附注射液主要治疗阳虚所致的各种疾病，成分主要为人参皂苷和去甲乌头碱，人参皂苷可改善心肌营养代谢，提高心肌收缩力。乌头碱则能显著提高心脏功能［9-10］。有证据显示参附注射液可抗氧化，去除氧自由基，降低细胞膜受到羟自由基的攻击［11-12］，改善微小循环［13-14］。顾云等发现参附注射液可降低大鼠心肌细胞凋亡，进而起到维护心脏的效用［15］。

综上所述，本实验采用腹主动脉部分缩窄方法诱导大鼠心功能的损害，并给予参附注射液抑制心肌损伤。结果表明与模型组比较，参附治疗组SOD活性显著升高，MDA含量、心肌凋亡蛋白Bcl-2/Bax显著降低，说明参附注射液能够通过抗氧自由基损伤，抑制心肌细胞凋亡和心脏功能的损害，这关乎参附注射液强大的抵挡被氧化的功能，详细机制有待后续探讨。

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Effects of Shenfu Injection on Oxidative Stress and Apoptosis in Rats with Heart Failure

DENG Meng，GUO Li，ZHANG Li.First Affiliated Hospital of Jiamusi University，Heilongjiang，Jiamusi 154002，China.

Objective：To investigate the effects of Shenfu Injection on oxidative stress and apoptosis in rats with heart failure.Methods：36 SD rats were randomly divided into three groups with 12 rats in each：the sham operation group，the heart failure model group and Shenfu treatment group.4 weeks after operation，the treatment group was given intragastric administration once a day daily dose：6.0 mL/（kg·d），for 4 weeks.The following data was detected：LVDS，LVDd，LVEF，FS，HR，LVSP，LVEDP，maximum rate of LVP，the content of the SOD and MAD and cardiac target protein.Results：Compared with the sham operation group，LVDd and LVDS of the model group increased obviously；LVEF and FS decreased obviously，and the level of BNP increased obviously（P< 0.05）.Compared with the model group，the indexes recovered after treatment of Shenfu Injection（P<0.05）.Compared with the sham operation group，LVEDP of the model group increased obviously；LVSP decreased，and+dp/ dt，Max，-dp/dt，Max and HR decreased obviously（P<0.01）.Compared with the model group，the indexes recovered after treatment of Shenfu Injection（P<0.01）.Compared with the sham operation group，the activity of SOD in the heart failure model group decreased obviously（P<0.01）.After treated with Shenfu Injection，the myocardial SOD activity was significantly higher than that in the heart failure model group（P<0.01）.The content of MDA in heart failure model group was significantly higher than that in sham operated group（P<0.01）.The content of MDA after the treatment of Shenfu Injection was lower than that in heart failure model group（P<0.01）.The expression of Bax protein was significantly decreased；the expression of Bcl-2 protein increased significantly，and theratio of Bax/Bcl-2 decreased significantly（P<0.01）.The linear correlation between SOD and Bcl-2/Bax was statistically significant（r=0.652，P<0.001），and linear positive correlation existed.Linearity of MDA and Bcl-2/Bax was statistically significant（r=-0.644，P<0.001），and linear negative correlation exists.Conclusion：Shenfu injection can decrease the level of oxidative stress，inhibit protein apoptosis，and thus improve cardiac function in heart failure rats and the mechanism may be related to the up-regulation of apoptosis inhibitory protein Bcl-2 and down-regulation of Pro apoptotic protein Bax.

Heart failure；Shenfu injection；Oxidative stress；Apoptosis

R285.5

A

1004-745X（2017）08-1401-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.08.025

2017-05-03）

黑龙江省佳木斯大学研究生科技创新项目（YZ2016-024）

△通信作者（电子邮箱：332910182@qq.com）