膝痛方对木瓜蛋白酶诱导的兔膝骨关节炎模型IL-1β、TNF-α、MMP-3的影响*

向文远 融 恺 郎 毅 陈平波 周瑜博

（新疆维吾尔自治区中医院，新疆 乌鲁木齐 830001）

膝痛方对木瓜蛋白酶诱导的兔膝骨关节炎模型IL-1β、TNF-α、MMP-3的影响*

向文远 融 恺 郎 毅 陈平波 周瑜博△

（新疆维吾尔自治区中医院，新疆 乌鲁木齐 830001）

目的 观察膝痛方对骨关节炎急发期动物模型白介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、基质金属蛋白酶-3（MMP-3）的调控作用。方法 28只新西兰白兔随机分为空白组、模型组、扶他林组、膝痛方组，各7只，于第1、4、7日向右膝关节内注射2%的木瓜蛋白酶和0.03 mol/L L-半胱氨酸混合液0.5 mL（空白组除外）。末次注射7 d后开始治疗。治疗14 d后，测右膝局部皮温，取右膝关节髌下脂肪垫组织处滑膜组织0.3 g，HE染色进行组织病理学观察，ELISA测定滑膜匀浆IL-1β、TNF-α、MMP-3浓度。结果 模型组右膝局部皮温略高于其他各组，但各组间差异并无统计学意义（P＞0.05）；与空白组比较，模型组滑膜增生明显，炎性细胞大量浸润，IL-1β、TNF-α、MMP-3明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，膝痛方组及扶他林组滑膜增生较少，少量炎性细胞浸润，IL-1β、TNF-α、MMP-3降低（P＜0.05）；与扶他林组比较，膝痛方组IL-1β、TNF-α水平与之差异无统计学意义（P＞0.05），而MMP-3则低于扶他林组（P＜0.05）。结论 膝痛方及扶他林均具有抑制膝骨关节炎急性期滑膜炎症反应的作用，且这种作用可能是通过降低IL-1β、TNF-α、MMP-3而实现的。此外，膝痛方抑制MMP-3的作用优于扶他林，提示膝痛方可能在远期抑制软骨退变，延缓膝骨关节炎病理进程方面具有潜在的疗效，仍需进一步研究。

膝痛方 膝骨关节炎 动物模型 木瓜蛋白酶 MMP-3

膝骨关节炎（KOA）是一种退行性骨关节疾病，临床主要表现为关节及其附属周围软组织疼痛、肿胀、压痛，关节活动受限，甚至畸形，最终丧失关节功能［1-3］。KOA急性期以膝关节肿痛、功能障碍为主要症状，KOA关节周围结构改变诱发滑膜炎症反应［4］，滑膜急性炎症进而引起的炎性疼痛又会进一步导致关节周围结构失稳以及软骨、韧带的退行性改变，进而加剧膝骨关节炎的病情［5］。因此在KOA急性期控制炎症反应，缓解关节疼痛，能从一定程度上控制KOA症状，延缓疾病的进程。中医学认为KOA急性期属“痹证”“热痹”范畴［6］。本院骨伤科在多年临床实践中总结并制定了治疗KOA急性期的经验方膝痛方，并在临床的治疗中取得了较好的疗效。为进一步探讨该方对KOA急性期的作用，本研究参照文献报道，以木瓜蛋白酶诱导的急性期膝骨关节炎为模型，以末次注射1周后为治疗切入时间点［7］，采用膝痛方治疗，以抗炎止痛药物扶他林为阳性对照，通过测量局部皮温，观察组织病理形态学改变，检测滑膜组织白介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、基质金属蛋白酶-3（MMP-3）水平，对比分析以阐释膝痛方治疗KOA急性期的潜在作用机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 28只健康新西兰大白兔，雌雄不限，平均兔龄5个月，平均体质量（2.3±0.3）kg，由郑州大学实验动物中心提供，许可证号：11804800001704。实验前适应性喂养1周，观察无全身疾患及异常后开始试验。本实验对动物的处理方法符合中华人民共和国科学技术部颁发的 《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.2 试药与仪器 膝痛方由生芪30 g，当归15 g，秦艽12 g，茜草9 g，川芎12 g，延胡索9 g，川萆薢12 g，防己12 g，土茯苓5 g，桑寄生12 g，川牛膝12 g，柴胡10 g，桂枝12 g，甘草3 g组成，统一由新疆维吾尔自治区中医院制剂室煎煮浓缩。扶他林（双氯芬酸钠缓释片，75 mg，10片/盒），北京诺华制药有限公司，国药准字：H10980297。木瓜蛋白酶（美国Sigma），L-半胱氨酸（美国Sigma），ELISA试剂盒（美国R&D），离心机（德国Eppendorf），光学显微镜（德国Leica DM1000），酶标仪（美国Bio-rad），红外测温仪（美国Fluke）等。

1.3 分组与造模 将28只兔子随机分为空白组、模型组、膝痛方组及扶他林组，各7只。于实验开始第1、4、7日，将兔子固定后，剔除右膝关节局部兔毛，75%酒精消毒后，固定关节，以髌韧带附着点外上方约0.5 cm处为进针点。针头从上前方向下后方倾斜刺入，以垂直方向推入，当出现落空感时，回抽无血性液体，注入0.5 mL 2%的木瓜蛋白酶和0.03 mol/L L-半胱氨酸混合液，活动膝关节使混合液充分分布在关节内，注射过程严格按照无菌操作要求［8］。

1.4 药物治疗 根据Meeh-Rubner公式［A（体表面积m2）=K（系数）×W（体质量）2/3×10-4］计算用量。膝痛方组每只平均约17.70 g生药，每只8 mL/d灌胃（每毫升含生药2.21 g）；扶他林组每只平均约10.73 mg双氯芬酸钠，将扶他林溶解于0.9%氯化钠注射液后，按每只8 mL/d灌胃（每毫升药量为1.34 mg）；空白组、模型组灌以等同剂量的生理盐水。灌胃开始时间均为末次注射木瓜蛋白酶后7 d，持续灌胃14 d。

1.5 标本采集与检测 治疗结束后，使用红外测温仪对兔膝关节正前方进行皮温测量。将红外测温仪探头中心处对准髌骨下缘，高度为1 cm，重复测量3次，取平均值。测量皮温后，各组动物均以空气栓塞法处死，大体观察右膝关节后，沿右膝前正中线切开皮肤，沿髌骨内、外侧缘切开关节囊，显露膝关节，切取髌下脂肪垫处滑膜组织0.3 g。将滑膜组织用蒸馏水冲洗后，一份迅速放入10%中性甲醛溶液中固定，用于病理组织观察；一份投入液氮中临时保存，再放入-80℃冰箱保存，ELISA检测备用。

1.6 病理组织学观察 滑膜组织经甲醛固定24 h，洗净后，梯度酒精（由50%到100%）脱水，二甲苯溶液透明约1 h，石蜡包埋切片。将切片放入苏木精染色液10 min，自来水水洗后，放入70%酒精配制的1%盐酸溶液中处理5 s左右，再放入1%氨水中蓝化10 min。随后，将切片放入0.5%的伊红中染色2 min左右，迅速水洗；最后，将切片放入由低到高的梯度酒精中逐级脱水，再放入二甲苯（Ⅰ、Ⅱ）溶液中各10 min，用中性树胶进行封片，显微镜下观察组织形态。

1.7 ELISA法测IL-1β、TNF-α、MMP-3浓度 将滑膜组织从-80℃冰箱取出，解冻后加适量PBS液，捣碎匀浆，3000 r/min离心10 min后取上清液检测。按照ELISA试剂盒说明书，配置试剂标准品，按顺序加入标准品及被测样品各50 μL于空白孔中，每组各设置3复孔，避光室温孵育2 h；将标准品及样品倒出，每孔加清洗缓冲液400 μL，轻摇均匀后倒出缓冲液，反复5遍，每次清洗5 min左右，每次清洗过后在滤纸上甩干；每孔加100 μL结合液，避光室温孵育2 h后，重复上述洗涤过程；每孔加100 μL基底结合液，避光室温孵育30 min；各孔加100 μL终止液，摇均匀，30 min内检测；使用酶联免疫检测仪在波长450 nm处读吸光度值数（OD值）；统计数据，绘制标准品浓度与标准品OD值标准曲线，计算IL-1β、TNF-α、MMP-3浓度。

1.8 统计学处理 应用SPSS22.0统计软件。计量资料以（±s）表示。计量资料满足正态性及方差齐性，采用单因素方差分析，否则采用秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 动物基本情况 在实验过程中动物生长良好，模型组开始造模后第7日，1只实验动物出现腹泻并饮食减少，于3 d后死亡。造模开始后，除空白组外其余各组在注射木瓜蛋白酶后当天饮食量和运动量减少，并于1～2 d后饮食逐渐恢复正常。

2.2 大体观察 见图1。空白组右膝关节正常，无关节积液及滑膜增厚等；模型组膝关节较健侧肿胀明显，皮肤颜色偏红，关节内可见少量关节积液，滑膜增厚明显，滑膜表面毛细血管增生较多。膝痛方组及扶他林组右膝关节肿胀不明显，皮肤颜色正常，皮温稍高，关节内无明显积液，滑膜增厚显呈暗红色。

图1 滑膜组织大体观察

2.3 各组右膝部皮温比较 见表1。模型组皮温总体略高于其他各组，但差异并无统计学意义（P＞0.05），这可能与皮肤温度相对较为稳定，波动范围较小有关。同时，膝痛方组与扶他林组比较，皮温均低于模型组，但二者间差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 各组治疗前后兔膝关节局部皮温比较（℃，±s）

表1 各组治疗前后兔膝关节局部皮温比较（℃，±s）

组别 n 皮温空白组 7模型组 6膝痛方组 7 39.19±0.29 40.16±0.37 39.38±0.28扶他林组 739.27±0.21

2.4 各组IL-1β、TNF-α、MMP-3水平比较 见表2。与空白组比较，模型组IL-1β、TNF-α、MMP-3水平明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，膝痛方组及扶他林组IL-1β、TNF-α、MMP-3水平降低（P＜0.05）；与扶他林组比较，膝痛方组IL-1β、TNF-α水平与之无明显差异（P＞0.05），而MMP-3则低于扶他林组（P＜0.05）。

表2 各组IL-1β、TNF-α、MMP-3水平比较（pg/mL，±s）

表2 各组IL-1β、TNF-α、MMP-3水平比较（pg/mL，±s）

与模型组比较，*P＜0.05；与扶他林组比较，△P＜0.05。

组别 n IL-1β TNF-α MMP-3空白组 7模型组 6膝痛方组 7 103.15±5.78*115.29±4.69*42.78±4.59*191.76±6.53 185.76±8.25 103.16±7.12 156.42±10.69*142.68±10.17*63.56±9.83*△扶他林组 7153.71±9.48*139.43±9.43*74.13±7.69*

2.5 组织病理学观察 见图2。HE染色显示：空白组滑膜组织正常，无增生及炎性细胞浸润；模型组滑膜组织增生明显，达5～6层，细胞间及滑膜外层见大量炎性细胞浸润以淋巴细胞和单核细胞为主，间质纤维组织增生明显。膝痛方组及扶他林组滑膜组织增生，达2～3层，有少量炎性细胞浸润，间质纤维组织增生明显。

图2 滑膜组织病理学观察（HE染色，400倍）

3 讨 论

膝关节是人体最大和最为复杂的关节，具有特殊的解剖特点及应力载荷，因此KOA是骨关节炎中最为常见的一种退变性骨关节炎性疾病。一般认为，KOA是多个具有相似生理学、形态学及临床结局的关节内疾病的总和，包括关节软骨退变，软骨下骨硬化，软骨下骨囊性变，反复发作的滑膜慢性炎症反应及韧带、关节囊、半月板的退行性改变等［9-10］。在KOA急发期，关节内产生大量骨与软骨的降解产物，这些产物一旦进入滑液，将刺激临近的滑膜组织并引发滑膜炎性反应，滑膜巨噬细胞分泌增多，关节腔内大量炎性因子聚集，如IL-1β、TNF-α等，加重软骨细胞的代谢紊乱，同时炎性因子的聚集使滑膜巨噬细胞及软骨细胞大量分泌基质金属蛋白酶（MMPs），加剧软骨基质的降解，使软骨的形态和生理功能发生明显的改变，进一步导致关节周围结构失稳以及软骨、韧带的退行性改变，加速KOA的病理进程［4-5，13-15］。可见滑膜炎症反应是KOA急性期的重要病理改变。如果在KOA急性期能及时控制滑膜的炎症反应，将对稳定KOA症状，延缓其疾病进程具有重要的临床意义。

目前中医学认为膝骨关节炎急发期多以 “水湿”“热毒”和“血瘀”为主，治疗多以除湿止痛、清热解毒、活血化瘀为主，但膝骨关节炎发病的内在根本在于肝肾的虚衰，因此在治疗各期的膝骨关节炎是都应辅以调补肝肾以治其本。膝痛方是本院骨科在临床实践中总结并提出的针对KOA急性期的验方，在临床治疗中取得了较好的疗效。全方由黄芪、当归、秦艽、茜草、川芎、延胡索、川萆薢、防己、土茯苓、桑寄生、川牛膝、柴胡、桂枝、甘草组成。方中以黄芪、当归为君，补气血，和营卫，使气机通畅，瘀毒消散；同时臣以茜草、川芎、萆薢等药，助君药化湿散瘀、活血行气、通络止痛；此外佐以桑寄生、牛膝以通经活血、补益肝肾，以治其本；同时桂枝温通经脉，佐制药物寒凉之性。诸药合用，使气血调畅，湿热得清，瘀毒得化，肝肾得补，标本兼治。

大量实验研究表明，中药复方治疗骨关节炎疾病的机制主要包括三个方面。其一，下调软骨基质降解酶的表达，减轻其对软骨基质成分的降解作用；其二，下调包括促炎性因子在内的多种细胞因子基因的转录和表达水平，进而减轻细胞因子介导的炎症反应及软骨代谢紊乱；其三，减少软骨细胞凋亡，促进软骨细胞增殖，增加软骨细胞胶原蛋白、蛋白聚糖的表达。本研究选用木瓜蛋白酶诱导的兔膝骨关节炎为疾病模型，并参照文献，以炎性反应最为明显的造模开始后2周为治疗切入点。选用扶他林为阳性药物对照，通过对形态学及细胞因子水平的观察对比，笔者发现膝痛方及扶他林能有效减轻KOA急性期膝关节的红肿情况，且组织病理学观察显示，膝痛方及扶他林均能抑制滑膜组织的增生及炎性细胞的浸润，有效控制滑膜炎症反应。此外，膝痛方及扶他林均能降低滑膜IL-1β、TNF-α、MMP-3等细胞因子的水平，说明二者可能是通过抑制IL-1β、TNF-α等前炎性因子起到控制滑膜炎症反应的，同时，二者对MMP-3的调控作用，说明膝痛方及扶他林能通过抑制MMP-3的水平进而缓解软骨基质的降解，对软骨起到一定的保护作用。值得注意的是，膝痛方治疗后，滑膜组织中MMP-3的水平降低更为明显，这提示膝痛方可能在远期抑制软骨退变，延缓膝骨关节炎病理进程方面具有潜在的疗效，但仍需进一步研究。

综之，通过本研究，笔者认为膝痛方能通过抑制IL-1β、TNF-α等前炎性因子进而控制膝骨关节炎急性期滑膜炎性反应，且膝痛方也可以降低滑膜细胞分泌MMP-3的水平，对软骨细胞起到一定的保护作用，值得进一步的研究和推广运用。

［1］ Qi L，Tang Y，You Y，et al.Comparing the effectiveness of electroacupuncture with different grades of knee osteoarthritis：a prospective study［J］.Cell Physiol Biochem，2016，39（6）：2331-2340.

［2］ Askari A，Naghizadeh MM，Homayounfar R，et al.Increased serum levels of IL-17A and IL-23 are associated with decreased vitamin D3 and increased pain in osteoarthritis［J］. PLoS One，2016，11（11）：e0164757.

［3］ 王庆丰，武理国，祝海炳.刺血配合外敷消炎膏治疗膝骨关节炎急性发作疗效观察［J］.中国中医急症，2013，22（9）：1589-1590.

［4］ Felson DT，Niu J，Neogi T，et al.Synovitis and the risk of knee osteoarthritis：the MOST study［J］.Osteoarthritis Cartilage，2016，24（3）：458-464.

［5］ Roemer FW，Guermazi A，Felson DT，et al.Presence of MRI-detected joint effusion and synovitis increases the risk of cartilage loss in knees without osteoarthritis at 30-month followup：the MOST study［J］.Ann Rheum Dis，2011，70（10）：1804-1809.

［6］ 刘秀娟，王玉明.清热解毒止痛方对膝骨关节炎急性期ESR、CRP的影响及疗效［J］.中国生化药物杂志，2016，36（7）：112-114.

［7］ 孙鲁宁，赵燕华，黄桂成，等.木瓜蛋白酶诱导膝关节骨关节炎模型兔滑膜病理变化与药物注射时间的关系［J］.中国组织工程研究与临床康复，2011，15（50）：9311-9313.

［8］ 张新玉.骨关节炎发病机理的研究进展［J］.河北医学，2016，22（4）：666-668.

［9］ Alves JC，Santos AM.Evaluation of the effect of mesotherapy in the management of osteoarthritis-related pain in a police working dog using the canine brief pain inventory［J］.Top Companion Anim Med，2017，32（1）：41-43.

［10］ Pottenger LA，Phillips FM，Draganich LF.The effect of marginal osteophytes on reduction of varus-valgus instability in osteoarthritic knees［J］.Arthritis Rheum，1990，33（6）：853-858.

［11］Ghandali E，Moghadam ST，Hadian MR，et al.The effect of Tai Chi exercises on postural stability and control in older patients with knee osteoarthritis［J］.J Bodyw Mov Ther，2017，21（3）：594-598.

［12］Dor A，Kalichman L.A myofascial component of pain in knee osteoarthritis［J］.J Bodyw Mov Ther，2017，21（3）：642-647.

［13］van der Kraan PM，van den Berg WB.Chondrocyte hypertrophy and osteoarthritis：role in initiation and progression of cartilage degeneration［J］.Osteoarthritis Cartilage，2012，20（3）：223-232.

［14］Felson DT，Gale DR，Elon GM，et al.Osteophytes and progression of knee osteoarthritis［J］.Rheumatology（Oxford），2005，44（1）：100-104.

［15］Sazo-Rodríguez S，Méndez-Rebolledo G，Guzmán-Muñoz E，et al.The effects of progressive neuromuscular training on postural balance and functionality in elderly patients with knee osteoarthritis：a pilot study［J］.J Phys Ther Sci，2017，29（7）：1229-1235.

Effect of Xitong Decoction on the Expression of IL-1β，TNF-α and MMP-3 in Rabbit Model of Knee Osteoarthritis Induced by Papain

XIANG Wenyuan，RONG Kai，LANG Yi，et al. Traditional Chinese Medicine Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region，Xinjiang，Urumqi，830001，China.

Objective：To investigate the effect of Xitong Decoction on the expression of IL-1 beta，TNF-alpha and MMP-3 in the acute phase of osteoarthritis model.Methods：28 New Zealand white rabbits were randomly divided into the control group，the model group，Voltaren group，Xitong Decoction group，with 7 rats in each.At different time of the experiment（1st/4th/7th day），0.5 mL mixture composed of 2%papain and 0.03 mL-cysteine were injected into the right knee of rabbits.7 days after the end of the intra-articular injection，the treatment started.2 weeks after the treatment，local skin temperature of knee was recorded.Meanwhile，the synovium and infrapatellar fat pad separated from right knees were obtained for histopathological observation and enzyme linked immunosorbent assay（ELISA）.Results：In the model group，the local skin temperature of the right knee was slightly higher than that of the other groups，but there was no significant difference between the groups（P>0.05）. Compared with the control group，synovial hyperplasia was obvious and inflammatory cells were infiltrating in the model group.The levels of IL-1，TNF-α，and MMP-3 increased significantly（P<0.05）.Compared with，there was no significant difference in the level of IL-1 beta and TNF-alpha between Votalin group and Xitong Decoction group（P>0.05），but MMP-3 in Xitong Decoction group was lower than that of Votalin group（P<0.05）.Conclusion：Xitong Decoction and Votalin both can inhibit the inflammatory reaction of synovium in acute phase of knee osteoarthritis，and this effect may be achieved by lowering IL-1 beta，TNF-alpha and MMP-3.In addition，the inhibition of MMP-3 of Xitong Decoction is better than that of Votalin，but it may have a potential therapeutic effect on the long-term inhibition of cartilage degeneration and delaying the pathological process of knee osteoarthritis，but it still needs further study.

Xitong Decoction；Knee osteoarthritis；Animal model；Papain；MMP-3

R285.5

A

1004-745X（2017）08-1343-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.08.009

2017-04-10）

新疆维吾尔自治区科技厅科研课题（201433110）

△通信作者（电子邮箱：18553354680@163.com）