HPLC法测定食品接触材料中BPA迁移量的不确定度评定

李灿明，柏建国

（奥瑞金包装股份有限公司，北京101407）

HPLC法测定食品接触材料中BPA迁移量的不确定度评定

李灿明，柏建国

（奥瑞金包装股份有限公司，北京101407）

参考GB/T 23296.16-2009《食品接触材料高分子材料食品模拟物中2，2-二（4-羟基苯基）丙烷（双酚A）的测定高效液相色谱法》测定食品接触材料（金属空罐）的双酚A迁移量。通过分析测定过程中的各种不确定度来源，计算各不确定度分量，得出金属空罐的双酚A迁移量为0.005 53 mg/dm2，扩展不确定度为0.000 38 mg/dm2。比较各不确定度分量大小可知，高效液相色谱法测定食品接触金属空罐双酚A迁移量的不确定度主要来自双酚A标品的纯度和标准曲线的拟合。

高效液相色谱；食品接触材料；双酚A；不确定度

双酚A是一种重要的食品接触材料添加剂，主要用于生产环氧树脂和聚碳酸酯，广泛应用于金属涂层类、塑料类和需要粘合剂的复合包装类等食品接触材料。该类食品接触材料中残留或分解产生的双酚A单体与食品接触时有可能迁移至食品中[1-3]。双酚A具有一定的毒性，大鼠经口半数致死量（Lethal Dose 50%，LD50）为 3 250 mg/kg，吸入暴露 LD50为 0.02%，小鼠经口LD50为2 400 mg/kg，而且其对机体生殖系统、胚胎发育、免疫系统、神经系统等均具有一定的影响[4-5]。基于风险评估，GB 9685-2016《食品安全国家标准食品接触材料及制品用添加剂使用标准》中规定了食品接触材料中双酚A的迁移限量为0.6 mg/kg[6]。

测量不确定度是表征赋予被测量值分散性的非负参数[7]。不确定度的来源有很多，取样、样品处理、结果计算等一切测量过程都会产生不确定度。本试验以GB/T 23296.16-2009《食品接触材料高分子材料食品模拟物中2，2-二（4-羟基苯基）丙烷（双酚A）的测定高效液相色谱法》为参考方法[8]，对食品接触材料中双酚A迁移量进行测定，并依据JJF 1059.1-2012《测量不确定度评定与表示》对该测量过程进行不确定度分析和评定，以期找出影响不确定度的主要因素，为实验室进一步提高检测结果的可靠性和准确性提供技术依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料

双酚A标准品：纯度为99.6%，美国Accustandard公司生产；试验用食品接触材料：691#酸性饮料空罐。

1.1.2 仪器

液相色谱（附FLD检测器）：Agilent 1290 Infinity；AL204型电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；感量0.000 1 g；罐体高度检测仪：嘉仪仪器（香港）有限公司，分辨力0.01 mm；电子数显卡尺：哈尔滨量具刃具集团有限责任公司，分辨力0.01 mm。

1.2 方法

本试验参考相关国家标准[8]，对食品接触材料中双酚A迁移量进行测定。

1.2.1 标准贮备液的配制

准确称取双酚A标准品50.0 mg（精确至0.1 mg），置于50 mL容量瓶中，用甲醇定容，即为1 000 mg/L标准贮备液。

1.2.2 标准曲线

1.2.2.1 标准中间液的配制

取1 mL标准贮备液于1 000 mL容量瓶中，用甲醇定容，即为1 mg/L标准中间液。

1.2.2.2 系列标准工作液配制

分别准确量取 0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10 mL 标准中间液于6个100 mL容量瓶中，用3%乙酸溶液定容，混合均匀，得到双酚A溶度分别为0.00、20.0、40.0、60.0、80.0、100 μg/L 的标准工作液。

1.2.2.3 绘制标准曲线

将系列标准工作液进样检测，以峰面积-浓度作图，得到标准曲线回归方程。

1.2.3 样品处理

1.2.3.1 模拟试验

从一批样品中随机抽取两个样品，用电子数显卡尺测量其内径，记为d1、d2。用超纯水清洗样品内壁，然后分别加入250 mL食品模拟液（3%乙酸溶液），用罐体高度检测仪测量其液面高度，记为h1、h2。将样品封盖后放入灭菌锅中，100℃处理30 min。

1.2.3.2 试样测试

将保温后的样品迅速冷却至室温，开盖量取食品模拟物样品（3%乙酸溶液）1 mL，通过0.2 μm滤膜过滤后供液相色谱进样。

1.2.4 色谱条件

色谱柱：Eclipse Plus C18柱，2.1×50 mm，1.8 μm；流动相：甲醇+水=60+40（体积比）；流速：0.2 mL/min；进样量：1 μL；柱温箱温度：30 ℃；荧光检测器：激发波长235 nm，发射波长312 nm。

1.2.5 测定

式中：Y为双酚A特定迁移量，mg/dm2；C为从标准曲线上查出的进样溶液中双酚A的浓度，mg/L；V为模拟液的体积，mL；S为模拟液与测试材料接触面积，cm2；h为模拟液在罐体中的高度，cm；d为罐体内径，cm。

1.2.6 试验测定结果

试验过程中相关参数的测定结果见表1。

表1 试验测定结果Table 1 Experimental determination results

2 不确定度的来源

测定过程中不确定度主要来源：（1）测试样品特定迁移量的不准确uM（Y），包括测试样品模拟液浓度的不准确、模拟试验中模拟液用量的不准确和模拟试验中模拟液与罐体接触面积的不准确；（2）样品代表性不够引起的不确定度，即通过样本估计总体引入的不确定度u（估计）；（3）结果修约引起的不确定度u（修约）。不确定度分量汇总表如表2所示。根据以上分析，结合1.2.5的测定公式，可知：

3 不确定度的评定

3.1 测试样品特定迁移量导致的不确定度

3.1.1 测试样品模拟液浓度引入的不确定度

3.1.1.1 双酚A标准贮备液配制引起的不确定度

A、双酚A纯度引起的不确定度

依据双酚A标品证书，其纯度为99.6%，其相对扩展不确定度为5%（k=2），故由标准品纯度引入的标准不确定度为：

相对标准不确定度为：

B、称量引起的不确定度

称量时，天平的分辨力为0.000 1 g，区间半宽为0.000 1/2=0.000 05 g，按均匀分布，由分辨力引起的标准不确定度为：

表2 不确定度分量汇总表Table 2 The summary table of uncertainty component

此外还有天平的准确性引入的不确定度，依据检定证书，电子天平在该称量范围的最大允差为±0.000 5 g，按均匀分布，则其标准不确定度为：

将上述两项不确定度合成，由称量引起的标准不确定度为：

相对标准不确定度为：

C、体积引起的不确定度

配制标准贮备液时使用50 mL容量瓶，允差±0.10mL，按均匀分布，其标准不确定度为：

相对标准不确定度为：

由以上3项合成可得标准贮备液配制引起的相对标准不确定度为：

3.1.1.2 标准储备液稀释引入的不确定度

A、移液枪引起的不确定度

B、容量瓶引起的不确定度

配制标准曲线溶液使用容量瓶100mL和1000mL，允差分别为±0.20 mL和±0.80 mL；按均匀分布，其标准不确定度分别为0.462；相对标准不确定度分别为0.115/100=1.15×10-3和 0.462/1 000=4.62×10-4。

本试验用5 mL移液枪，依据检定规程其允差分别为：取 1mL，允差±（1×1%）=±0.010 mL；取 2mL，允差±（2×0.5%）=±0.010 mL；取 3mL，允差±（3×0.5%）=±0.015 mL；取 4mL，允差±（4×0.6%）=±0.024 mL；取 5 mL，允差±（5×0.6%）=±0.030 mL。

按均匀分布，其标准不确定度分别为：取1 mL，标准不确定度；取 2 mL，标准不确定度取 3 mL，标准不确定度；取4 mL，标准不确定度；取5 mL，标准不确定度

各浓度点的相对标准不确定度分别为：浓度点20 μg/L，相对标准不确定度 5.774×10-3/2=2.887×10-3；浓度点40 μg/L，相对标准不确定度 1.386×10-2/4=3.465×10-3；浓度点 60 μg/L，相对标准不确定度；浓度点 80 μg/L，相对标准不确定度浓度点100 μg/L，相对标准不确定度2.450×10-3；浓度点 1 000 μg/L（标准中间液），相对标准不确定度 5.774×10-3/1=5.774×10-3。

由各浓度点的相对标准不确定度合成，可得移液枪引起的相对标准不确定度为：

合成相对标准不确定度为：

由移液枪引起的不确定度和容量瓶引起的不确定度合成，可得标准储备液稀释引起的相对标准不确定度为：

3.1.1.3 标准曲线拟合所得样品浓度引起的不确定度

计算标准曲线拟合所得样品浓度引起的不确定度所用相关统计数据见表3、表4。

由表4可得，峰面积标准偏差为：标准溶液浓度偏差的平方和为：

表3 标准曲线浓度-峰面积结果Table 3 Results of concentration-peak area of standard curve fitting

表4 标准曲线上所得值与实际测量值之间的标准偏差及标准偏差平方和Table 4 Standard deviation and standard deviation quadratic sum of measured value and actual value of standard curve fitting

则曲线拟合所得样品浓度x0的标准不确定度为：

式中：n为曲线拟合时标准溶液测定的次数，本次测定为5；p为样品测定的次数，本次测定为1次；a为斜率。

相对标准不确定度为：

urel（拟合）=0.747 305/39.11=1.911×10-2

由以上分析可知，由标准曲线所得样品浓度引起的不确定为：

3.1.2 模拟试验中模拟液用量不准确导致的不确定度

模拟试验中用250 mL量筒量取250 mL模拟液，其引起的不确定度包括量筒未查明的偏倚和量筒体积随温度的变化。

A、量筒未查明的偏倚：

250 mL量筒的允差为±1.0 mL，按均匀分布，其标准不确定度为：

B、量筒体积随温度的变化：

根据检定规程JJG196-2006《常用玻璃量器》中6.2，其标定的容积为20摄氏度时的容积，然而实验室的温度变化范围为18至26摄氏度，距20摄氏度的最大温差为6摄氏度，由于温度变化而导致体积变化，体积变化量服从均匀分布，水（3%乙酸）的体积膨胀系数为1.8×10-3/℃，由此导致的标准不确定度为：

将上述两项合成，由模拟液用量不准确引起的标准不确定度为：

相对标准不确定度为：

3.1.3 模拟试验中模拟液与罐体接触面积不准确导致的不确定度

3.1.3.1 罐体内径不准确引起的不确定度

用电子数显卡尺测量罐体内径，其不确定度包括测试时的随机波动和电子数显卡尺未查明的偏倚。

A、测试时的随机波动（用分辨力引入的不确定度代替）：

该电子数显卡尺的分辨力为0.001 cm，区间半宽为0.001/2=0.000 5 cm，按均匀分布，由分辨力引起的标准不确定度为：

B、电子数显卡尺未查明的偏倚：

该电子数显卡尺的允差为±0.002 cm，按均匀分布，其标准不确定度为：

将上述两项合成，由罐体内径不准确引起的标准不确定度为：

3.1.3.2 罐体模拟液液面高度不准确引起的不确定度

用罐体高度检测仪测量罐体液面高度，其不确定度包括测试时的随机波动和罐体高度检测仪未查明的偏倚。

A、测试时的随机波动（用分辨力引入的不确定度代替）：

该罐体高度检测仪的分辨力为0.001 cm，区间半宽为0.001/2=0.000 5 cm，按均匀分布，由分辨力引起的标准不确定度为：

B、罐体高度检测仪未查明的偏倚：

该罐体高度检测仪的允差为±0.002 cm，按均匀分布，其标准不确定度为：将上述两项合成，由罐体液面高度不准确引起的

标准不确定度为：

将3.1.3.1和3.1.3.2两项合成，由模拟液与罐体接触面积的不准确引起的标准不确定度为：

相对标准不确定度为：

urel（S）=u（S）/S=4.618×10-2/176.754=2.613×10-4

3.2 样品代表性不够引入的不确定度

样品的双酚A特定迁移量的极差为0.00006mg/dm2，用样本极差估计总体标准差的修偏系数为1.13（n=2），总体标准差的估计值为0.000 06/1.13=5.310×10-5mg/dm2。故：

3.3 双酚A特定迁移量结果修约导致的不确定度

由于修约间隔为0.000 01，由此导致的标准不确定度为：

3.4 合成不确定度

3.5 扩展不确定度

取扩展因子k=2，扩展不确定度为：U（Y）=2×uc（Y）=2×0.000 189 2=0.000 378 4≈0.000 38mg/dm2。

3.6 结果

样品测定结果为：Y=0.005 53±0.000 38 mg/dm2。

4 结论

本次试验检测691#酸性饮料空罐的双酚A迁移量结果为（0.005 53±0.000 38）mg/dm2，其相对扩展不确定为6.87%，且其结果远小于GB 9685-2016规定的双酚A迁移限量0.6 mg/kg（相当于0.1 mg/dm2）。从各不确定度分量结果来看，双酚A纯度引起的相对标准不确定度urel（纯度）=2.500×10-2和标准曲线拟合引起的相对标准不确定度urel（拟合）=1.911×10-2是影响整体测量不确定度的主要因素。

[1] 郭春海,陈瑞春,赵安康,等.聚碳酸酯奶瓶中双酚A单体向食品模拟物迁移规律的研究[J].食品科学,2011,32(12):246-250

[2] 孙汉文,李辉,高文惠,等.食品包装材料中双酚A迁移量的测定[J].食品科学,2012,33(2):235-239

[3] 张彦丽,任佳丽,李忠海,等.食品包装材料中双酚A的研究进展[J].食品与机械,2011,27(1):155-157,174

[4] 王佳,詹平.双酚A对机体影响及其机制的研究进展[J].预防医学情报杂志,2005,21(5):541-544

[5] 杨丹,李丹丹,刘姗姗,等.双酚A对机体的影响及其作用机制[J].现代预防医学,2008,35(17):3280-3282,3287

[6]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.GB 9685-2016.食品安全国家标准食品接触材料及制品用添加剂使用标准[S].北京:中国标准出版社,2017

[7]国家质量监督检验检疫总局.JJF 1059.1-2012.测量不确定度评定与表示[S].北京:中国标准出版社,2013

[8]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局,中国国家标准化管理委员会.GB/T 23296.16-2009.食品接触材料高分子材料食品模拟物中2,2-二(4-羟基苯基)丙烷(双酚A)的测定高效液相色谱法[S].北京:中国标准出版社,2009

Uncertainty Evaluation for the Determination of Bisphenol A Migration of Food Contacted Materials by HPLC

LI Can-ming，BAI Jian-guo
（ORG Packaging Co.，Ltd.，Beijing 101407，China）

To base on GB/T 23296.16-2009，the bisphenol A migration in food contacted materials（metal cans）was determined.By analyzing and calculating the various sources of uncertainty during the entire determination process，the amount of the bisphenol A migration in metal cans was 0.005 53 mg/dm2with expanded uncertainty of 0.000 38 mg/dm2.Comparison the amount of each uncertainty，the uncertainty of the bisphenol A migration in food contacted materials（metal cans）determined by HPLC mainly came from the purity of bisphenol A and the fitting of standard curve.

HPLC；food contacted materials；bisphenol A；uncertainty

2017-01-03

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.18.032

李灿明（1984—），男（汉），硕士，主要研究方向：食品包装有害物迁移。