6种菊花抗氧化活性及总酚含量的研究

杨璐齐，陈冠林，俞憬，王煜坤，高永清，傅南琳

（1.广东药科大学食品科学学院，广东中山528458；2.佛山市职业病防治所，广东佛山528000；3.广东药科大学附属第一医院，广东广州510008）

6种菊花抗氧化活性及总酚含量的研究

杨璐齐1，陈冠林2，俞憬1，王煜坤1，高永清1，傅南琳3，*

（1.广东药科大学食品科学学院，广东中山528458；2.佛山市职业病防治所，广东佛山528000；3.广东药科大学附属第一医院，广东广州510008）

采用DPPH、ABTS和FRAP 3种方法测定了6种菊花的抗氧化活性并用福林-酚法测定其总酚含量。结果表明：依据其总酚含量和抗氧化活性，6种菊花均是很好的抗氧化剂来源。FRAP、DPPH和ABTS试验显示，黄金菊的抗氧化活性最强，其 FRAP、DPPH 和 ABTS 值分别为 150.22、125.19、173.47 μmol Trolox/g。此外，总酚测定结果表明，黄金菊的总酚含量最高。

抗氧化性；总酚；菊花

菊花（chrysanthemum），学名为Dendranthemamorifolium（Ramat.）Tzvel，为菊科（Asteraceae）植物菊花的干燥头状花序，是一种常见的药食两用的花卉，具有清热、明目、疏风、解毒之功效[1-2]，可用于治疗头痛眩晕、风热感冒、眼目昏花以及目赤肿痛。菊花在中国具有3 000多年的栽培历史，按产地和加工方法的不同，分为“杭菊”、“贡菊”、“毫菊”、“怀菊”、“滁菊”、“祁菊”、“济菊”和“黄菊”八大主流品种[3]。菊花的主要化学成分为黄酮类、单萜类、蒽醌类、倍半萜以及三萜类等化合物，具有抗炎、抗菌、抗肿瘤以及降血脂等多种生物学活性[4-7]。从目前掌握的文献来看，虽然有不少人对菊花提取物及其抗氧化性进行了相关的研究[2，8-11]，但对菊花中酯化酚（esterified phenolics）以及难溶性酚（insoluble-bound phenolics）的研究较少。因此，本研究以菊花为原料，以一定比例的乙醇提取其中的游离酚（free phenolics）后，应用碱液对提取液及提取残渣水解而获得酯化酚和难溶性酚，测定其多酚含量，并系统地测定了菊花多酚的抗氧化活性，旨在为开发菊花多酚提供依据。

1 材料

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

6种菊花（杭白菊、黄金菊、胎菊、洋金菊、黄山贡菊、金菊花）：购于广东省佛山市某市场。

1.1.2 试验试剂

Trolox （6-hydroxy-2，5，7，8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid，水溶性维生素 E）、ABTS（2，2-azinobis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid，2，2'-联氨-双-3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸）以及福林-酚试剂（Folin-Ciocalteu reagent）：美国 Sigma公司；TPTZ（2，4，6-tris-2，4，6-tripiridyl-2-triazine，三吡啶三吖嗪）和 DPPH（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）：阿拉丁公司；乙醇、FeCl3、HCl、乙酸钠、过硫酸钾、没食子酸、乙醇（分析纯）：天津化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

UV-9600紫外/可见分光光度计：北京瑞利分析仪器有限公司；LEO-150S超声清洗仪：昆山力波超声波设备有限公司；ACQUITY UPLC H-CLASS超高效液相色谱仪：美国Waters公司；HD-100高速多功能粉碎机：诸暨市海道机械有限公司；SY2000旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；SHZ-Ⅲ型循环水真空泵：上海亚荣生化仪器厂。

1.3 样品的制备

菊花购回后用粉碎机粉碎，过20目筛备用。

2 方法

2.1 酚类的水解

准确称取1.00 g样品，加入50 mL 40%乙醇，超声波辅助浸提10 min后将提取液过滤，水相减压蒸馏至20 mL左右后用6 mol/L HCl调pH至2，用乙酸乙酯（1∶1，体积比）萃取3次。乙酸乙酯相经混合减压蒸馏（50℃）至干后溶于50%甲醇中，获得游离酚（free phenolics）。于萃取游离酚后的水相中加入30 mL 4 mol/L NaOH，室温下用氮吹仪吹入氮气水解4 h，然后用 6 mol/L HCl调至 pH2，再用乙酸乙酯（1∶1，体积比）萃取3次，乙酸乙酯相经混合减压蒸馏至干后溶于50%甲醇中，获得酯化酚（esterified phenolics）。在开始过滤后的提取物残渣中加入20 mL 4 mol/L NaOH，室温下用氮吹仪吹入氮气水解4 h，然后用6 mol/L HCl调至pH2，过滤后用乙酸乙酯（1∶1，体积比）萃取3次，乙酸乙酯相混合减压蒸馏至干后溶于50%甲醇中，获得难溶性酚（insoluble-bound phenolics）[12]。

2.2 总酚含量的测定

取0.10 mL待测样品，加入2.50 mL Folin-Ciocalteu试剂中，反应4 min后，加入2.00 mL 75 g/L的Na2CO3溶液，置室温下反应120 min，于760 nm下测定吸光度。结果以没食子酸当量（gallic acid equivalents，GAE）表示，单位为 mg GAE/g[13-14]。

2.3 FRAP法测定抗氧化活性

FRAP试剂由10 mmol/L的TPTZ（溶于40 mmol/L盐酸）、20 mmol/L的三氯化铁、300 mmol/L的乙酸钠缓冲液（pH3.6）以1∶1∶10（体积比）的比例混合而成。取100 μL待测样品，加入3 mLFRAP溶液中充分混合，反应120 min后于593 nm处测定吸光度。以Trolox溶液为标样作标准曲线，样品的抗氧化活性用μmol Trolox/g 表示[15-16]。

2.4 DPPH法测定抗氧化活性

取0.1 mL待测样品，加入0.06 mmol/L DPPH 80%乙醇溶液3.9 mL，振荡15 s，放置暗处反应2 h后，于515 nm处测定吸光度，按以下公式计算清除率：

清除率/%=（A对照-A样品）×100/A对照。式中：A对照为对照组的吸光度，A样品为样品的吸光度。

以3.9 mL DPPH+0.1 mL 80%乙醇作对照、80%乙醇作空白，以Trolox溶液为标样作标准曲线，样品的抗氧化活性用Trolox当量表示，单位为μmol Trolox/g[17]。

2.5 ABTS法测定抗氧化能力

将7 mmol/L的ABTS（用pH值为4.5、20 mmol/L的乙酸钠配制）和2.45 mmol/L的过硫酸钾等体积混合，室温下避光反应12 h～16 h，形成ABTS储备液。使用前用20 mmol/L乙酸钠（pH4.5）将ABTS储备液稀释成为工作液，使其在734 nm处吸光度为0.700±0.005。取100 μL待测样品，加入3 mL ABTS工作液，室温下反应2 h后，在734 nm处测定吸光度。以20 mmol/L乙酸钠（pH4.5）为空白，ABTS工作液为对照，以Trolox溶液为标样作标准曲线，样品的抗氧化活性用TEAC（trolox equivalent antioxidant capacity）表示[15]，单位为μmol Trolox/g。

3 结果与分析

3.1 线性关系

多酚、FRAP、DPPH以及ABTS线性方程、相关系数和线性范围见表1。

表1 多酚、FRAP、DPPH以及ABTS线性方程、相关系数和线性范围Table 1 Linear equations，correlation coefficients and linear ranges of polyphenol content，FRAP，DPPH and ABTS

从表1可以看出，在测定范围内多酚、FRAP、DPPH以及ABTS 4种测定方法具有很好的线性关系。

3.2 6种菊花中游离酚、酯化酚以及难溶性酚的含量

种菊花中游离酚、酯化酚以及难溶性酚的含量见表2。

表2 6种菊花中游离酚、酯化酚以及难溶性酚的含量Table 2 The phenolic contents of free phenolics，esterified phenolics，and insoluble-bound phenolics from 6 kinds of chrysanthemums

从表2可知，6种菊花总酚含量差别较大，其中黄金菊的游离酚含量最高，其次是杭白菊、金菊花，而黄山贡菊的游离酚含量最低。黄金菊的酯化酚和难溶性酚含量也高于其他5种菊花。黄山贡菊的酯化酚酚含量最低，而胎菊的难溶性酚含量最低。6种菊花的游离酚含量均高于酯化酚和难溶性酚。杭白菊、黄金菊、洋金菊、黄山贡菊以及金菊花的难溶性酚含量高于酯化酚。Li等[18]研究发现，菊花游离酚含量高于难溶性酚。Xiong等[19]研究发现，杭白菊的游离酚含量高于难溶性酚，这与本研究的结果是一致的。而Kaisoon等[20]研究发现，珊瑚藤、叶子花、硫华菊、悬铃花、龙船花、荷花以及万寿菊的难溶性酚含量高于其游离酚。

3.3 游离酚、酯化酚以及难溶性酚的铁离子还原能力

游离酚、酯化酚以及难溶性酚的铁离子还原能力见表3。

表3 6种菊花游离酚、酯化酚以及难溶性酚的铁离子还原能力Table 3 Ferric reducing antioxidant powers of free phenolics，esterified phenolics and insoluble-bound phenolics from 6 kinds of chrysanthemums

从表3可知，各种菊花的抗氧化能力均较强。就游离酚而言，黄金菊的FRAP值最高，其次是杭白菊、金菊花，而洋金菊的FRAP值最低；就酯化酚而言，洋金菊的FRAP值最高，杭白菊的FRAP值最低；而对难溶性酚的测定结果是，洋金菊的FRAP值最高，其次是黄金菊、胎菊，金菊花的FRAP值最低。在测定的6种菊花中，游离酚的抗氧化能力均高于酯化酚和难溶性酚；黄山贡菊和金菊花酯化酚的FRAP值高于难溶性酚。Li等[18]研究发现，菊花游离酚的铁离子还原能力高于难溶性酚；Xiong等[19]研究发现，杭白菊游离酚的铁离子还原能力高于难溶性酚，这与本研究的结果是一致的。而万寿菊游离酚的铁离子还原能力低于难溶性酚[20]。

3.4 游离酚、酯化酚以及难溶性酚的DPPH自由基清除能力

游离酚、酯化酚以及难溶性酚的DPPH自由基清除能力见表4。

表4 6种菊花游离酚、酯化酚以及难溶性酚的DPPH自由基清除能力Table 4 DPPH radical scavenging activities of free phenolics，esterified phenolics and insoluble-bound phenolics from 6 kinds of chrysanthemums

从表4可知，各种菊花对DPPH自由基的清除能力均较强。就游离酚而言，黄金菊对DPPH自由基的清除能力最强，其他依次是杭白菊、金菊花、黄山贡菊，洋金菊对DPPH自由基的清除能力最弱；就酯化酚而言，胎菊对DPPH自由基的清除能力最强，其次是洋金菊和黄山贡菊；而对难溶性酚的测定结果是，洋金菊对DPPH自由基的清除能力最强，黄山贡菊对DPPH自由基的清除能力最弱。在测定的菊花中，游离酚对DPPH自由基的清除能力均高于酯化酚和难溶性酚；杭白菊、黄金菊以及洋金菊难溶性酚对DPPH自由基的清除能力均高于酯化酚。研究发现，万寿菊水溶性酚的DPPH自由基清除能力高于难溶性酚[20]。Wang等[21]研究发现，未经硫熏的菊花提取物有较高的DPPH自由基清除能力，其EC50值为0.079 mg/mL，而经硫熏后的菊花提取物对DPPH自由基的清除能力比未经硫熏的提取物低，其EC50值为0.085 mg/mL。菊花提取物还具有抗炎[22]、抗黑色素生成、抗氧化[23]以及抗糖尿病[24]等多种生物学活性。

3.5 游离酚、酯化酚以及难溶性酚的ABTS自由基清除能力

游离酚、酯化酚以及难溶性酚的ABTS自由基清除能力见表5。

表5 6种菊花游离酚、酯化酚以及难溶性酚的ABTS自由基清除能力Table 5 ABTS radical cation scavenging activities of free phenolics，esterified phenolics and insoluble-bound phenolics from 6 kinds of chrysanthemums

从表5可知，各种菊花对ABTS自由基的清除能力均较强。就游离酚而言，黄金菊对ABTS自由基的清除能力最强，其他依次是黄山贡菊、杭白菊以及胎菊，金菊花对ABTS自由基的清除能力最弱；就酯化酚而言，胎菊对ABTS自由基的清除能力最强，其他依次是洋金菊、黄山贡菊以及金菊花，杭白菊对ABTS自由基的清除能力最弱；就难溶性酚而言，洋金菊对ABTS自由基的清除能力最强，杭白菊对ABTS自由基的清除能力最弱。在测定的6种菊花中，游离酚对ABTS自由基的清除能力均高于酯化酚和难溶性酚；杭白菊、黄金菊、洋金菊、黄山贡菊以及金菊花难溶性酚对ABTS自由基的清除能力均高于酯化酚。Li等[18]研究发现，菊花游离酚对ABTS自由基的清除能力高于难溶性酚，其游离酚和难溶性酚的ABTS值分别为8.11 μmol Trolox/g和0.12 μmol Trolox/g，低于本研究的6种菊花。Xiong等[19]研究发现，杭白菊游离酚对ABTS自由基的清除能力高于难溶性酚，但其难溶性酚对ABTS自由基的清除能力低于本研究的杭白菊。

4 结论

本研究采用DPPH、ABTS和FRAP 3种方法分别测定了6种菊花的抗氧化活性，并用Folin-Ciocalteu法测定其总酚含量。结果表明，6种菊花表现出不同的抗氧化活性，其中黄金菊的抗氧化活性最强，总酚含量也最高。

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Antioxidant Activities and Total Phenolic Contents of Six Kinds of Chrysanthemum

YANG Lu-qi1，CHEN Guan-lin2，YU Jing1，WANG Yu-kun1，GAO Yong-qing1，FU Nan-lin3，*
（1.School of Food Science，Guangdong Pharmaceutical University，Zhongshan 528458，Guangdong，China；2.FoshanInstituteofOccupationalDiseasePreventionandControl，Foshan528000，Guangdong，China；3.TheFirstHospitalAffiliatedtoGuangdongPharmaceuticalUniversity，Guangzhou510008，Guangdong，China）

DPPH，ABTS and FRAP methods were used to determine the antioxidant activities of six kinds of chrysanthemum[Dendranthema morifolium（Ramat.）Tzvel]，and Folin-Ciocalteu method was used to determine their total phenolic contents.Results indicated that six kinds of chrysanthemum were significant sources of an－tioxidants in terms of their total phenolic contents and antioxidant activities.In FRAP，DPPH and ABTS assays，chamomile （Perennial chamomile）exhibited the highest antioxidant activity with the values of 150.22，125.19 μmol Trolox/g and 173.47 μmol Trolox/g respectively.In addition，in Folin-Ciocalteu assay，chamomile exhibited the highest total phenolic content.

antioxidant activity；total phenolic content；chrysanthemum[Dendranthema morifolium（Ramat.）Tzvel

2016-12-26

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.18.002

广东省医学科学技术研究基金项目（A2015617）；中医药强省建设专项资金第二批名中医师承项目（粤中医办函[2015]93号）

杨璐齐（1992—），女（苗），在读硕士，研究方向：营养与食品安全。

*通信作者：傅南琳（1964—），女，主任医师，研究方向：中药天然产物与健康关系的研究。