六堡茶总黄酮对小鼠化学性肝损伤的保护作用

钱波，周燕园，王程强，任源，顾廉洁，宋家乐，3，4，*

（1.桂林医学院公共卫生学院/预防医学研究所，广西桂林541000；2.广西高校预防医学重点实验室，广西桂林541000；3.CHA医科大学食品生命工学系/生物技术研究所，韩国抱川11160；4.重庆市功能性食品协同创新中心，重庆400067）

六堡茶总黄酮对小鼠化学性肝损伤的保护作用

钱波1，2，周燕园1，王程强1，2，任源1，2，顾廉洁1，宋家乐1，2，3，4，*

（1.桂林医学院公共卫生学院/预防医学研究所，广西桂林541000；2.广西高校预防医学重点实验室，广西桂林541000；3.CHA医科大学食品生命工学系/生物技术研究所，韩国抱川11160；4.重庆市功能性食品协同创新中心，重庆400067）

探讨六堡茶总黄酮（LBTFE）对小鼠化学性肝损伤的保护作用及机制。给予肝损伤小鼠不同剂量LBTFE灌胃15 d后，测定体重并计算肝脏指数。检测血清肝功能相关指标酶（天门冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶、乳酸脱氢酶）和炎性因子（肿瘤坏死因子-α和白介素-6）水平。测定肝脏超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、过氧化氢酶和丙二醛及离子通道酶活性。LBTFE能降低肝损伤小鼠血清肝功能相关指标酶、炎性因子和肝脏丙二醛水平。LBTFE还能增强抗氧化物酶，谷胱甘肽及离子通道酶的活力（p＜0.05）。结果显示，LBTFE对小鼠化学性肝损伤有一定程度的保护作用，其机制可能与增强内源性抗氧化系统和调控离子通道酶的活性有关。

六堡茶；总黄酮；化学性肝损伤；抗氧化；ATP酶

六堡茶为我国传统茶叶制品中黑茶的一种，原产于广西壮族自治区苍梧县六堡乡并因此得名[1]。在制茶工艺上，六堡茶属富含矿物质的后发酵茶[2-3]。其汤红味醇并具有槟榔口味，广西当地群众认为其是具有减肥、降脂疗效的健康保健饮品，销量不断增加。近年的科学研究发现，六堡茶具有较好的抗氧化[4]、降血脂[5-6]、提高免疫力[7-8]，降低胰岛素抵抗[9]、抗凝血[9]以及抗衰老[10]等多种生物学功效。

氧化应激所引发的肝脏损伤及炎症反应是肝脏疾病发生的重要原因之一[11]。为进一步开发和利用六堡茶资源。本研究拟通过建立在保肝药物活性筛选实验中常用的CCl4诱导的化学性肝损伤动物模型[12]来观察六堡茶总黄酮对化学性肝损伤的保护作用，为六堡茶的产业发展提供一定的试验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

成年昆明小鼠 42只，雄性，体重（20±2）g，由桂林医学院实验动物中心提供（许可证号：SCXK桂2013-0001），置于桂林医学院公共卫生学院动物房进行饲养（室温18℃～22℃，湿度60%～70%）。

1.2 实验试剂

六堡茶（生产年份：2015年8月）：广西梧州六堡茶厂；水飞蓟素胶囊（每片含水飞蓟素38.5 mg，批号：20160506）：上海朝辉制药厂；四氯化碳CCl4（国产分析纯）：济南宏巨化工有限公司；冬氨酸氨基转移酶（aspartate transaminase，AST）、丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）、超氧化物歧化酶（su peroxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、离子通道酶（Na+/K+-ATPase和Ca2+/Mg2+-ATPase）酶测定试剂盒：南京建成生物工程研究所，其他化学试剂为国产分析纯。

1.3 仪器与设备

EYELA N-1001S真空旋转蒸发仪：日本东京理化器械株式会社；Eppendorf 5424R冷冻离心机：德国Eppendorf公司；ELx808酶标仪：美国BioTek公司。

1.4 六堡茶总黄酮乙醇提取物的制备

取经冷冻干燥后的六堡茶粉碎品100 g，依料液比1∶25（g/mL）比例，加入60%的乙醇溶液混合提取3次，每次提取1.5 h[13]。在4 000 r/min的速度下将所以提取液离心20 min后收集上清液。低温旋转蒸发制备得六堡茶总黄酮提取物，并将提取物抽真空包装后置于-80℃条件下保管待用。经三氯化铝比色法测定六堡茶提取物中总黄酮含量为3.57%[10]。

1.5 实验方法

总42只小鼠适应性饲养1周后。禁食8h后，所有小鼠随机分为正常对照组、CCl4模型组、水飞蓟阳性对照组、六堡茶总黄酮提取物低、中、高剂量组，每组7只。除正常对照组小鼠外，其他小鼠均按照10 mL/kg的剂量一次性腹腔注射0.1%的CCl4溶液（以玉米油配制）建立小鼠化学性肝损伤模型。造模成功后，六堡茶总黄酮低、中、高处理组分别经口给予50、100、200 mg/kg六堡茶总黄酮提取物灌胃处理。水飞蓟组给予50 mg/kg剂量灌胃处理，正常对照组和CCl4模型组给予等容量的蒸馏水，每天1次，连续15 d。末次给药后禁食12 h，实验动物乙醚麻醉后自腹部中央静脉处取血，3 000 r/min离心15 min制备血清。依照试剂盒说明书用比色法测定肝脏损伤指标酶AST、ALT、ALP、LDH水平及炎性细胞因子TNF-α、IL-6的含量。在超净台无菌状态下取出已牺牲小鼠的肝脏，用预冷的生理盐水制备10%肝匀浆，3 000 r/min离心15 min后取上清液比色法测定肝脏中SOD、GSH、CAT、MDA水平及Na+/K+-ATPase、Ca2+/Mg2+-ATPase活性，详见试剂盒操作方法。

1.6 统计学处理

数据应用SPSS17.0统计软件分析，实验结果均以均数加减标准差表示（所有实验均重复3次），用单因素方差分析（ANOVA）进行多组之间均数的差异性检验，p＜0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 六堡茶总黄酮提取物对实验小鼠体重以及一般状态的影响

六堡茶总黄酮对CCl4诱导化学性肝损伤小鼠体重、肝脏重量以及肝脏脏器指数的影响见表1。

如表1所示，CCl4模型组与正常组相比，体重、肝脏重量、肝脏脏器指数均出现明显升高（p＜0.05）。六堡茶总黄酮提取物100、200 mg/kg组与CCL4模型组相比，小鼠肝脏重量和肝脏脏器指数显著降低（p＜0.05）。

2.2 六堡茶总黄酮提取物对CCl4诱导肝损伤小鼠血清AST、ALT、ALP和LDH水平的影响

氧化损伤和炎症反应的发生是CCl4引起肝脏损伤的主要机制。CCl4在细胞色素氧化酶P450作用下生成大量自由基引起生物膜功能与结构被破坏，造成肝脏细胞坏死，并最终导致肝脏炎症的发生及肝脏细胞中大量坏死性生物酶释放入血[14]。六堡茶总黄酮对CCl4诱导肝损伤小鼠血清AST、ALT、ALP和LDH水平的影响见表2。

表1 六堡茶总黄酮对CCl4诱导化学性肝损伤小鼠体重、肝脏重量以及肝脏脏器指数的影响Table 1 Effect of Liubao tea total flavonoid on body weight，liver weight and liver index in CCl4-treated mice

表2 六堡茶总黄酮对CCl4诱导肝损伤小鼠血清AST、ALT、ALP和LDH水平的影响Table 2 Effect of Liubao tea total flavonoid on the serum levels of AST，ALT，ALP and LDH in CCl4-treated mice

如表2所示，模型组小鼠血清中ALT、AST、ALP、LDH水平较正常组小鼠呈显著升高趋势（p＜0.05）。六堡茶总黄酮100、200 mg/kg组中的血清ALT、LDH的水平及六堡茶总黄酮提取物各剂量组中的AST、ALP水平与模型组相比均出现显著降低（p＜0.05）。

2.3 六堡茶总黄酮对CCl4诱导肝损伤小鼠血清TNF-α和IL-6水平的影响

体内自由基过多蓄积可以激活肝库普弗细胞内NF-κB介导的信号通路并产生大量的TNF-α、白介素等促炎症细胞因子进而引发肝脏炎症反应[15]。六堡茶总黄酮对CCl4诱导肝损伤小鼠血清TNF-α和IL-6水平的影响见表3。

表3 六堡茶总黄酮对CCl4诱导肝损伤小鼠血清TNF-α和IL-6水平的影响Table 3 Effect of Liubao tea total flavonoid on the serum levels of TNF-α and IL-6 in CCl4-treated mice

如表3所示，模型组小鼠血清炎性细胞因子TNF-α和IL-6的水平较正常组小鼠显著升高（p＜0.05），六堡茶总黄酮100、200 mg/kg组血清中TNF-α和IL-6水平与模型组相比均出现明显降低（p＜0.05）。

2.4 六堡茶总黄酮对CCl4诱导肝脏损伤后肝脏氧化损伤指标酶活性的影响

氧化应激导致的生物膜破坏是CCl4引起肝脏损伤主要原因[11]。抗氧化物酶SOD和CAT以及非酶抗氧化物质GSH所构成的内源性抗氧化系统是机体防御自由基导致的氧化应激损伤的重要参与者[16]。SOD负责将机体内自由基转化为过氧化氢，而CAT、GSH又将过氧化氢降解为水，以此构成了抗氧化防御链[17]。六堡茶总黄酮对CCl4诱导肝损伤小鼠肝脏SOD、GSH、CAT和MDA水平的影响见表4。

如表4所示，CCl4模型组与正常组相比抗氧化酶SOD和CAT的活性，GSH水平出现不同程度降低（p＜0.05），脂质过氧化物产物MDA水平显著升高（p＜0.05）。六堡茶总黄酮200 mg/kg组肝脏组织中SOD、CAT酶活性，GSH水平与CCl4模型组相比出现显著升高（p＜0.05），同时六堡茶总黄酮各剂量组肝脏组织中MDA水平也显著降低（p＜0.05）。

表4 六堡茶总黄酮对CCl4诱导肝损伤小鼠肝脏SOD、GSH、CAT和MDA水平的影响Table 4 Effect of Liubao tea total flavonoid on the liver levels of SOD，GSH，CAT and MDA in CCl4-treated mice

2.5 六堡茶对CCl4诱导肝脏损伤后离子通道酶的影响

肝损伤的机制十分复杂，近年有研究显示CCl4会通过自由基的产生抑制离子通道酶的活性进而导致细胞的坏死[18]。离子通道酶Na+/K+-ATPase和Ca2+/Mg2+-ATPase存在于内质网膜、线粒体膜和细胞膜上，它们对维持细胞正常代谢，保证细胞内离子平衡等生物学功能具有重要作用。Ca2+/Mg2+-ATPase酶活性受到抑制后会使Ca2+内流增加而引起细胞内Ca2+超载，导致线粒体内能量代谢障碍、膜电位降低，引起组织中ATP含量下降，激发胞浆内磷脂酶、蛋白酶等酶而引起一系列的细胞损伤[19]。肝脏细胞由于是体内物质合成代谢的主要器官，存在较多的线粒体。Na+/K+-ATPase是维持线粒体膜流动性正常的关键酶，其活性下降会引起胞内Na+超载进而激活Na+-Ca2+交换蛋白，加重胞内Ca2+超载，阻碍线粒体膜的正常流动性，从而造成线粒体功能障碍[20]。六堡茶总黄酮对CCl4诱导肝损伤小鼠肝脏Na+/K+-ATPase和Ca2+/Mg2+-ATPase水平的影响见表5。

表5 六堡茶总黄酮对CCl4诱导肝损伤小鼠肝脏Na+/K+-ATPase和Ca2+/Mg2+-ATPase水平的影响Table 5 Effect of Liubao tea total flavonoid on the liver levels of Na+/K+-ATPase and Ca2+/Mg2+-ATPase in CCl4-treated mice

如表5所示，CCl4模型组与正常组相比离子通道酶Na+/K+-ATPase、Ca2+/Mg2+-ATPase活性出现降低（p＜0.05）。六堡茶总黄酮200 mg/kg处理组中Ca2+/Mg2+-ATPase活性和六堡茶总黄酮100、200 mg/kg组中Na+/K+-ATPase的活性与CCl4模型组相比均出现升高（p＜0.05）。

3 结论

本研究中，我们发现六堡茶总黄酮能有效降低CCl4所致肝损伤小鼠体内肝功能相关指标酶（ALT、AST、ALP、LDH）和血清炎性因子（TNF-α、IL-6）水平。同时，六堡茶总黄酮也可以抑制小鼠受损肝脏组织发生氧化损伤（即抑制MDA水平的升高）。此外，六堡茶总黄酮还能有效地提高肝损伤小鼠肝脏中抗氧化物酶（SOD、CAT）活性和非酶抗氧化物质GSH的含量，并同时上调Na+/K+-ATPase、Ca2+/Mg2+-ATPase这两种离子通道酶的活性。综合上述，结果提示六堡茶总黄酮可能主要通过增强小鼠肝脏中内源性抗氧化体系的活力和通过调控Na+/K+-ATPase、Ca2+/Mg2+-ATPase的活性来缓解CCl4对肝脏所造成的损伤。

[1] 苏悦娟,孔璎红,孔祥军,等.茶叶生态原产地产品保护分析-以六堡茶为例[J].食品研究与开发,2014,35(10):124-128

[2] 韦静峰,文兆明.广西六堡茶[J].广西农学报,2008,23(3):45-47

[3] 张雪红,谢兰强,黄淑媛.辐照和充氧处理对六堡茶中矿物质含量的影响[J].食品研究与开发,2011,32(9):23-26

[4] 郝再彬,吴琼,蒋泽军,等.广西六堡黑茶生物学功效的研究[J].东北农业大学学报,2013,44(11):68-72

[5] 黄宇声,张栩颜,刘冠萍,等.六堡茶降脂作用试验研究[J].中国保健营养,2013(3):875-876

[6] 黄丽,彭静静,夏宁,等.六堡茶调节高血脂症与抗凝血的功能特性研究[J].食品科技,2013,38(8):123-128

[7] 邓聿胤,黄宇声,刘冠萍,等.六堡茶对小鼠免疫功能的影响[J].云南中医中药杂志,2013,34(2):50-51

[8] 刘冠萍,黄宇声,张栩颜,等.六堡茶对小鼠免疫功能的影响[J].中国医药指南,2013,11(3):484-485

[9] 滕翠琴,刘仲华,龚受基,等.六堡茶对胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞糖脂代谢的影响[J].茶叶科学,2014,34(3):230-238

[10]宋家乐,周燕园,赵超超,等.六堡茶总黄酮对老龄小鼠抗氧化功能的影响[J].食品研究与开发,2016,37(20):173-176

[11]吴娜,蔡光明,何群.氧化应激与肝脏损伤[J].世界华人消化杂志,2008,16(29):3310-3315

[12]Weber LWD,Boll M,Stampfl A.Hepatotoxicity and Mechanism of Action of Haloalkanes:Carbon Tetrachloride as a Toxicological Model[J].Critical Reviews in Toxicology,2003,187(2):511-517

[13]罗艳,苏志恒,蒋艳萍.六堡茶中总黄酮的提取工艺研究[J].食品工业,2014,35(1):161-164

[14]Karakus E,Karadeniz A,Simsek N,et al.Protective effect of Panax ginseng against serum biochemical changes and apoptosis in liver of rats treated with carbon tetrachloride(CCL4)[J].J Hazard Mater,2011,195(1):208-213

[15]Yang BY,Zhang XY,Guan SW,et al.Protective Effect of Procyanidin B2 against CCl4-Induced Acute Liver Injury in Mice[J].Molecules,2015,20(7):12250-12265

[16]Bachschmid MM,Schildknecht S,Matsuir R,et al.Vascular aging:chronic oxidative stress and impairment of redox signaling-consequences for vascular homeostasis and disease[J].Ann Med,2013,45(1):17-36

[17]Wang X,Wang W,Li L,et al.Oxidative stress and mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease[J].BiochimBiophysActa,2014,1842(8):1240-1247

[18]韩志强,巴图德力根,娜日苏,等.蒙药德都红花-7味散对慢性肝损伤大鼠肝组织SOD,MDA及肝线粒体钠钾ATP酶活性的影响[J].中华中医药学刊,2013(5):1076-1078

[19]陈振兴,赵瑞芝.醋柴胡不同部位对肝郁模型大鼠肝脏Na+-K+ATP酶、Ca2+-Mg2+ATP酶活性及P-糖蛋白mRNA表达的影响[J].中国中医药杂志,2016(9):3721-3724

[20]Shattock MJ,Ottolia M,Bers DM,et al.Na+/Ca2+exchange and Na+/K+-ATPase in the heart[J].J Physiol,2015,593(6):1361-1382

Protective Effect of Liubao Tea Total Flavonoid on Chemical Induced Liver Injury Mice

QIAN Bo1，2，ZHOU Yan-yuan1，WANG Cheng-qiang1，2，REN Yuan1，2，GU Lian-jie1，SONG Jia-le1，2，3，4，*
（1.School of Public and Health/Institute of Preventive Medicine，Guilin Medical University，Guilin 541000 Guangxi，China；2.Guangxi Colleges and University Key Laboratory of Preventive Medicine，Guilin 541000 Guangxi，China；3.Department of Food Science and Biotechnology/Institute of Biotechnology，CHA Medical University，Pocheon 11160，Korea；4.Chongqing Collaborative Innovation Center of Functional Food，Chongqing 400067，China）

To study the protective effect of Liubao tea total flavonoid（LBTFE）on chemical induced liver injury mice，the treated mice were treated with different dose of LBTFE for 15 days.The body weight and liver index was measured at the end of experimental period.The serum levels of aspartate transaminase （AST），alanine aminotransferase（ALT），alkaline phosphatase（ALP），lactate dehydrogenase（LDH）and tumor necrosis factor（TNF）-α，interleukin（IL）-6 were determined by commercial assay kits.Hepatic levers of superoxide dismutase（SOD），catalase（CAT），glutathione（GSH），malondialdehyde（MDA），and Na+/K+-ATPase，Ca2+/Mg2+-ATPase were determined by commercial assay kits.LBTFE treatment reduced the serum levels of ALT，ALP，LDH，TNF-α，IL-6 and MDA in liver damage mice.LBTFE also increased the liver levels of SOD，CAT，GSH and Na+/K+-ATPase，Ca2+/Mg2+-ATPase in liver damage mice（p＜0.05）.These results suggested that the LBTFE exhibited a protective effect to against the liver injury may associated with the increasing of endogenous antioxidant system and regulating the activity of Na+/K+-ATPase and Ca2+/Mg2+-ATPase in chemical induced liver damage mice.

Liubao tea；total flavonoid；chemical liver injury；antioxidant；ATPase

2016-12-29

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.18.038

广西壮族自治区教育厅中青年教师基础能力提升项目（KY2016YB328、KY2016YB321）；广西壮族自治区“大学生创新创业训练计划”资助项目（201510601076,201510601080）；桂林医学院引进人才科研启动基金（04010150001）

钱波（1989—），男（汉），讲师，硕士，研究方向：食品毒理学。

*通信作者：宋家乐（1983—），男（汉），副教授，博士，研究方向：功能性食品学。