人参玛咖片对运动小鼠抗疲劳活性的实验研究

王雪，张欣蕊，安升淑，吴红红，姜雪，康杰，华正杰，张馨元，周毓麟，*

（1.吉林大学生命科学学院，吉林长春130012；2.通化百泉保健食品有限公司，吉林通化134000；3.吉林省社会科学院日本研究所，吉林长春130033）

人参玛咖片对运动小鼠抗疲劳活性的实验研究

王雪1，张欣蕊1，安升淑1，吴红红1，姜雪1，康杰2，华正杰2，张馨元3，周毓麟1，*

（1.吉林大学生命科学学院，吉林长春130012；2.通化百泉保健食品有限公司，吉林通化134000；3.吉林省社会科学院日本研究所，吉林长春130033）

研究人参玛咖片对运动小鼠的抗疲劳作用。试验设置人参玛咖片3个剂量组和空白对照组，通过自主活动、疲劳转棒、耐力跑及负重游泳试验，考察人参玛咖片对小鼠耐力的影响，通过检测小鼠游泳前和游泳后即刻血清和肝脏中三磷酸腺苷（ATP）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、睾酮（T）、雌二醇（E2）和孕酮（PROG）水平，探究人参玛咖片的抗疲劳作用机制。结果表明：自主活动实验表明人参玛咖片对小鼠中枢神经系统没有损伤。与空白对照组相比，人参玛咖片能够显著的延长小鼠转棒、耐力跑及负重游泳力竭时间。与空白对照组相比，人参玛咖片显著提高了游泳后雌雄小鼠血清中ATP水平，同时显著提高了血清和肝脏中T-SOD和GSH-Px水平。与空白对照组相比，人参玛咖片提高了雌雄小鼠游泳后性激素T和PROG的水平。综合以上实验结果得知，人参玛咖片具有提高运动耐力和缓解疲劳的功效，这一作用可能与其抑制脂质过氧化损伤有关，同时能够改善小鼠体内性激素的分泌。

人参玛咖片；抗疲劳；性激素；小鼠

疲劳是一个十分复杂的生理病理现象，是机体脑力和体力活动到一定程度必然发生的，并受到多种因素的影响[1-2]。疲劳实际上是一种防止机体发生对生命造成威胁的机能衰竭而产生的保护性机制，同时也是机体发展成病理状态的前兆[3-4]。疲劳感在体内逐渐积累会导致过度紧张、内分泌失调，免疫系统功能低下，甚至脏器的病变[5]。近年来，在民间医学和现代科学实验基础上，不少学者在寻求抗疲劳药物方面做了大量的工作，特别是在中药的化学成分和作用机理的研究中，因此，在天然植物中寻找、筛选具有抗疲劳作用的有效成分、探讨其作用机制具有实际意义。

人参（Panax ginseng C.A.Mey）系五加科人参，属多年生草本植物，以根入药，俗称人衔、鬼盖、地精、孩儿参等，是古今著名的滋补强壮良药。近年来，国内外学者对人参的有效成分，进行了药理研究、临床观察和流行病学调查，结果均证实人参具有改善微循环、提高组织抗缺氧能力、抑制血小板聚集、抗肿瘤、抗衰老、抗辐射、抗疲劳等多种生物活性[6]。玛咖Lepidium meyenii（Maca），又称“秘鲁人参”或“南美人参”，为形似萝卜的块根类植物，属十字花科[7]，代医学研究证明，玛咖具有增强生育能力、改善性功能、抗疲劳、抗氧化、抗癌等药理作用[8-9]。目前，以玛咖为主要原料生产的各类保健品备受消费者的关注，因此成为当前研究的热点。但是大部分抗疲劳实验研究都是采用单一玛咖原粉或玛咖提取物，对玛咖与传统抗疲劳中草药复配作用效果缺乏研究。为探讨人参玛咖片的保健作用，本研究以小鼠为实验对象，采用“保健食品功能学评价程序和检验方法”中抗疲劳实验规定的方法进一步验证人参玛咖片的抗疲劳作用，旨在开发一种功效显著、专门针对疲劳人群的抗疲劳制剂。

1 材料与方法

1.1 实验样品

人参玛咖片中黑玛咖含量60%，池底参20%，剩余辅料为木糖醇、麦芽糖及微晶纤维素。使用前用0.9%生理盐水配成不同浓度灌胃小鼠。其剂量分别为0.4、0.8、1.6 g/kg体重，空白对照组给予等体积的0.9%生理盐水。

1.2 实验动物和检测条件

实验动物：选用SPF级健康昆明品系小鼠160只，雌雄各半，质量18 g～22 g，由辽宁长生生物技术有限公司提供（许可证号：SCXK（辽）2015-0001）。

检测环境条件：温度范围20℃～25℃，相对湿度范围40%～70%。小鼠试验前在动物房环境中适应5 d。

1.3 材料与仪器

三磷酸腺苷（ATP）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）、谷胱甘肽还原酶（GSH-Px）测定试剂盒：购自南京建成生物工程技术公司；睾酮（T）、雌二醇（E2）和孕酮（PROG）ELISA测定试剂盒：购自上海源叶生物技术公司；0.9%生理盐水：吉林科伦康乃尔制药有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒：Novagen，USA。SYNERGY4酶标仪：美国博腾仪器有限公司；96孔板：无锡耐思生物科技有限公司；OL-901漩涡混合器：江苏海门市麒麟医用仪器厂；101A-1E电热鼓风干燥箱：上海实验仪器厂有限公司；GSY-II恒温水浴锅：北京市医疗设备厂；Mini Spin高速离心机：德国Eppendorf；FT-200动物跑步机：成都泰盟科技有限公司；ZZ-6自主活动记录仪：成都泰盟科技有限公司；ZB-200疲劳转棒仪：成都泰盟科技有限公司。

1.4 实验方法[10]

1.4.1 动物分组及给药

用国家标准锯齿类动物干燥饲料适应性喂养3 d后（室温控制在25℃左右），将小鼠随机均分为4组：空白对照组、人参玛咖片低剂量组、人参玛咖片中剂量和人参玛咖片高剂量组，每组20只，分笼饲养。在每天固定时间段分别以 0.4、0.8、1.6 g/kg·bw 低、中、高剂量灌胃给药，灌胃体积为0.2 mL/20 g·BW，空白对照组灌以等体积0.9%的生理盐水，连续灌胃14 d，末次给药后禁食2 h（可自由饮水）。参考卫生部《保健食品检验与评价技术规范》（2003年版）中缓解体力疲劳功能检验方法，实验结束后进行各项抗疲劳指标的测定。

1.4.2 自主活动实验（旷场实验）

将各组灌胃后小鼠置于安静阴凉处，静置30 min，放入自主活动箱中，盖上避光板，使小鼠适应2 min后，记录小鼠5 min内的站立次数和活动次数，平行3次。

1.4.3 疲劳转棒实验

末次给药30 min后，将各组小鼠分别放在转棒仪上，使肌肉处于静力紧张状态，转速为20 r/min。各组小鼠进行实验前，对其进行适当训练，小鼠在转棒上跌落3次后，开始记录小鼠由于肌肉疲劳从转棒上跌下的时间，平行3次。

1.4.4 耐力跑实验

末次给药30 min后，将小鼠置于FT-200动物跑步机中，放置好动物后，对小鼠进行训练，使其了解逃离带电区域后，将转速设为20 r/min，电流调到最高，记录小鼠被电击5次的时间，以此作为力竭时间。

1.4.5 负重游泳实验

取昆明种小鼠160只，雌雄各半。随机分为4组，每组20只。按剂量设计连续灌胃14 d，于末次灌胃后30 min，将小鼠放入水中游泳，水深30 cm，水温（25±0.5）℃，鼠尾根部负荷10%体重的铅块，记录小鼠自游泳开始至力竭，作为小鼠的力竭游泳时间。以小鼠头部沉水后超过8 s还无法上浮，并且放在平面上不能完成翻正反射作为力竭判断标准。

1.4.6 血清中ATP、T-SOD和GSH-Px的测定

末次给小鼠受试物30 min后，在温度为（25±0.5）℃的水中不负重游泳30 min。取出小鼠擦干后，立即拔眼球采血0.8 mL，离心制备血清后放于-80℃冰箱保存待测。依照各自的试剂盒测定方法进行测定。

各指标的计算公式如下：

血清中总SOD活力/（U/mL）=（测定管吸光值-对照管吸光值）÷对照管吸光度÷50%×反应体系的稀释倍数

血清中GSH-Px酶活力（U）=（非酶管吸光值-酶管吸光值）÷（标准管吸光度-空白管吸光值）×标准管浓度（μmol/L）×稀释倍数×样本测试前稀释倍数

ATP浓度（μmol/gprog）=（测定管吸光值-对照管吸光值）÷（标准吸光度-空白吸光度）×标准品浓度（μmol/L）×样本测定前稀释倍数÷血红蛋白浓度（gHb/L）

1.4.7 血清中性激素T、E2和PROG的测定

末次给小鼠受试物30 min后，在温度为（25±0.5）℃的水中不负重游泳30 min。取出小鼠擦干后，立即拔眼球采血0.8 mL，4℃放置20 min后，离心取血清，依照T、E2和PROG ELISA试剂盒测定方法，测定小鼠游泳前和游泳后即刻血清中相应的激素含量。

1.4.8 肝脏中T-SOD和GSH-Px的测定

末次灌胃给药30 min后，每组随机抽取10只小鼠，采用1.4.5负重游泳模型，致小鼠力竭游泳后，脱颈处死，立即取同部位的一小块肝，称质量，冰浴下匀浆制备成10%肝匀浆液，以3 500 r/min的转速离心15 min，取上清，按照试剂盒上的说明测定肝脏匀浆液中的T-SOD和GSH-Px含量。

各指标的计算公式如下：

组织中总SOD活力/（U/mgprog）=（测定管吸光值-对照管吸光值）÷对照管吸光度÷50%×反应液总体积（mL）÷取样量（mL）÷组织中蛋白含量（mgprog/mL）

组织中GSH-Px酶活力（mgprog/mL）=（非酶管吸光值-酶管吸光值）÷（标准管吸光度-空白管吸光值）×标准管浓度（μmol/L）×稀释倍数÷反应时间（min）÷（取样量（mL）×样本蛋白含量（mgprog/mL））

1.5 实验数据处理

实验数据用平均值±标准差（X±SD）表示，统计分析采用SPSS13.0统计软件包，相关组间比较用t检验，差异具显著性水平为P＜0.05，差异具高度显著性水平为 P＜0.01。

2 结果与分析

2.1 人参玛咖片对小鼠质量的影响

人参玛咖片对小鼠体重的影响见表1。

表1 人参玛咖片对小鼠体重的影响（n=10，x±sd）Table 1 Effect of PL tablet on weight of mice（n=10，x±sd）

由表1可见，经口灌胃不同剂量的样品14 d，人参玛咖片各剂量组小鼠在实验初期、中期和末期体重与空白对照组比较均无显著性差异（F检验，P＞0.05）。

2.2 人参玛咖片对小鼠抗疲劳活性的影响

2.2.1 小鼠自主活动情况

人参玛咖片对小鼠自主活动的影响见表2。

表2 人参玛咖片对小鼠自主活动的影响（n=10，x±sd）Fig.2 Effect of PL tablet on autonomic activities of mice（n=10，x±sd）

由表2可见，经口灌胃给药14 d后，试验结果显示，人参玛咖片各剂量组与空白对照组相比，对雌雄小鼠的活动次数没有显著性影响，对雌雄小鼠的站立次数也没有显著性影响，均无统计学意义，因此，推测人参玛咖片对小鼠中枢神经系统可能无影响即不能对中枢神经造成损伤。

2.2.2 小鼠疲劳转棒时间

人参玛咖片对小鼠抗疲劳活性的影响见图1。

经口灌胃给药14 d后，与空白对照组相比，均能延长小鼠的转棒时间。在雌性小鼠中，低、中剂量影响极为显著（P＜0.01，图1A），尤其是中剂量效果最佳，不呈线性关系。在雄性小鼠中，中、高剂量影响极为显著（P＜0.01，图1A），以高剂量效果最佳，药效呈剂量依赖性。

图1 人参玛咖片对小鼠抗疲劳活性的影响Fig.1 The anti-fatigue effects of PL tablet on mice

2.2.3 小鼠耐力跑时间

经口灌胃给药14 d后，人参玛咖片组小鼠的跑步时间明显高于空白对照组，在雌性小鼠中，中、高剂量影响极为显著（P＜0.01，图1B），低剂量组无统计学意义。在雄性小鼠中，与空白对照组相比，低剂量影响显著（P＜0.05，图 1B），中、高剂量影响极显著（P＜0.01，图1B），从图中可以看出，中剂量更能缓解雌雄小鼠的疲劳程度。

2.2.4 小鼠负重游泳时间

经口灌胃给药14 d后，试验结果显示，雌性小鼠中，低、中剂量组的负重游泳力竭时间明显高于空白对照组，其中低剂量组具有显著性（P＜0.05，图1C），雄性小鼠中，高剂量组的负重游泳力竭时间高于空白对照组，具有极显著性（P＜0.01，图 1C）。

2.3 人参玛咖片对小鼠血清中ATP、T-SOD和GSHPx水平的影响

2.3.1 人参玛咖片对小鼠血清中ATP水平的影响

人参玛咖片对小鼠游泳前后血清中ATP水平的影响见图2。

图2 人参玛咖片对小鼠游泳前后血清中ATP水平的影响Fig.2 Effects on ATP status in serum of PL tablet in mice before and after swimming

人参玛咖片低、中、高剂量组相比较空白对照组均能显著的提高雌雄小鼠游泳前后血清中的ATP含量，在游泳前雌雄小鼠中，高剂量组较空白对照组有显著性影响（P＜0.05，图2A）。游泳后雌性小鼠中，低剂量组较空白对照组具有显著性影响（P＜0.05，图2B），中剂量组具有极显著影响（P＜0.001，图2B）。在游泳后雄性小鼠中，低、中剂量组较空白对照组有显著性影响（P＜0.05），高剂量组较空白组有极显著性影响（P＜0.001，图 2B）。

2.3.2 人参玛咖片对小鼠血清中T-SOD和GSH-Px水平的影响

人参玛咖片对小鼠游泳前后血清中SOD和GSHPx水平的影响见表3。

表3 人参玛咖片对小鼠游泳前后血清中SOD和GSH-Px水平的影响Table 3 The effects of PL tablet in serum of SOD and GSH-Px status in mice before and after swimming

由表3可见，与空白对照组相比，人参玛咖片明显提高了游泳前雌雄小鼠血清中SOD的含量，雌性小鼠中，低、高剂量组较空白组有极显著性差异（P＜0.01），游泳后雌雄小鼠血清中的SOD水平相比空白对照组有一定程度的升高，但无统计学意义。

2.4 人参玛咖片对小鼠血清中T、E2和PROG性激素水平的影响

2.4.1 对T含量的影响

人参玛咖片对小鼠游泳前后血清中3种性激素水平T、E2和PROG的影响见表4。

表4 人参玛咖片对小鼠游泳前后血清中3种性激素水平T、E2和PROG的影响Table 4 The effects of PL tablet in serum of T，E2 and PROG sex hormones status in mice before and after swimming

续表4 人参玛咖片对小鼠游泳前后血清中3种性激素水平T、E2和PROG的影响Continue table 4 The effects of PL tablet in serum of T，E2 and PROG sex hormones status in mice before and after swimming

由表4可见，人参玛咖片剂量组雌雄小鼠游泳前血清中T的含量无明显变化，游泳后血清中T的含量虽无统计学意义，但是相对空白对照组都有不同程度的提高，说明人参玛咖片可能具有较弱的升高T的作用。

2.4.2 对E2、PROG含量的影响

由表4可见，雌雄小鼠中，游泳前E2和PROG均没有升高趋势。游泳后雌雄小鼠血清中E2和PROG的含量较空白组有所提高，尤其是雄性小鼠中PROG含量，高剂量组较空白对照组有极显著性影响（P＜0.01）。

2.5 对肝脏中T-SOD和GSH-Px含量的影响

人参玛咖片对小鼠游泳前后肝脏中SOD和GSHPx水平的影响见表5。

表5 人参玛咖片对小鼠游泳前后肝脏中SOD和GSH-Px水平的影响Table 5 The effects of PL tablet on liver SOD and GSH-Px status in mice before and after swimming

从表5可见，游泳前后雌雄小鼠肝脏中总SOD含量较空白对照组有明显的升高，雌性小鼠中，低剂量和中剂量组具有极显著性差异（P＜0.01）。游泳后雌雄小鼠肝脏中GSH-Px水平相比较空白对照组有明显的上升，中剂量组具有显著性差异（P＜0.05），雄性小鼠中，高剂量组较空白对照组具有极显著差异（P＜0.01）。

3 结论与讨论

运动性疲劳是引起机体运动能力下降的主要原因，运动性力竭是疲劳的一种特殊形式，是运动性疲劳发展的最后阶段。耐力学实验和血清生化指标均可以反应动物运动疲劳的程度，是评价受试物是否具有抗疲劳活性的客观指标。运动耐力的提高是抗疲劳能力加强的主要指标，力竭时间是机体抗应激能力、抗疲劳能力等多种作用的综合体现，是衡量机体运动能力的重要直接参数[11]。本研究采用疲劳转棒、耐力跑和负重游泳耐力学实验考察人参玛咖片对运动小鼠的抗疲劳作用，与空白对照组相比，人参玛咖片显著延长了雌雄小鼠的转棒时间、耐力跑时间以及负重游泳力竭时间，本研究结合了3种耐力学实验方法，其结果更为可靠。

ATP作为生命活动的直接能源，是机体的主要供能物质，体内ATP含量变化可直接反应机体的供能状态和运动能力[12]。本研究中，人参玛咖片剂量组显著的提高雌雄小鼠游泳后血清中ATP含量，供能及时，延缓疲劳的产生。SOD和GSH-Px是生物体内重要的氧自由基清除剂，可以缓解机体运动后的疲劳感，具有一定的抗疲劳作用[13-14]，与空白对照组相比，人参玛咖片明显提高了游泳前雌雄小鼠血清中SOD的含量，游泳后雌雄小鼠血清中的SOD水平相比空白对照组有一定程度的升高，但无统计学意义，这可能与所选择的运动时间和强度有关，短时间运动后可使抗氧化酶系统活性升高，清除自由基效率明显，而较长时间的亚极限或高强度运动，尤其是力竭运动后，这些酶的活性则呈下降趋势，清除自由基的效率下降，因此，使人参玛咖片有较弱的升高SOD的作用，但在统计学上可能未表现出来。雌雄小鼠游泳前人参玛咖片剂量组血清的GSH-Px含量无明显变化，但是游泳后血清中GSH-Px含量较空白对照组均有所升高，说明人参玛咖片能有效提高小鼠血清中SOD和GSH-Px的活性，阻止或降低脂质过氧化反应，保护机体细胞免受损伤，延缓疲劳。Harman的“自由基学说”指出，过多的自由基会破坏体内氧化攻击和抗氧化保护的平衡，最终导致机体处于疲劳。正常的生理状态下，机体代谢产生的自由基会被体内的一些抗氧化酶和非酶成分如SOD和GSH-Px等清除[15-16]，从而达到一个稳定的状态，我们的研究结果证实了抗氧化与抗疲劳之间有密切关系。

已有研究表明，长时间大运动量训练造成的运动性低血睾酮症是机体运动能力下降和恢复过程延长的主要原因[17]，而睾酮作为人体内一个重要的促合成激素，它不仅可以维持男性性功能和副性特征，而且还可以刺激组织摄取氨基酸，促进核酸与蛋白质的合成[18]，人参玛咖片剂量组对雌雄小鼠游泳后血清中T具有较弱的升高作用。E2和PROG是参与调节雌性动物生殖机能的主要性腺激素，人参玛咖片对雌雄小鼠游泳前E2和PROG含量较空白对照组没有显著影响，但游泳后雌雄小鼠血清中E2和PROG的含量较空白组有所提高。根据“保健食品功能学评价程序和检验方法”中抗疲劳实验结果判定规则：“若1项以上（含1项）运动试验和2项以上（含2项）生化指标结果阳性，即可判定该受试样品具有抗疲劳的作用。”综合以上实验结果，说明人参玛咖片具有提高小鼠的运动耐力及缓解体力疲劳的功效。

SOD和GSH-Px是机体内抗氧化系统中重要的酶，在清除自由基方面起到非常关键的作用。本实验中，人参玛咖片明显提高了游泳前后雌雄小鼠血清和肝脏中SOD和GSH-Px的水平，表明抗自由基途径是人参玛咖片发挥抗疲劳作用的途径之一。ATP被称为最直接，最快速的能量来源，急性或力竭运动会使肌肉内[H+]含量升高，抑制肌原纤维ATP酶，导致ATP合成受阻，人参玛咖片剂量组能够提高游泳后雌雄小鼠血清中ATP水平，雌性小鼠中，低剂量组具有显著性影响（P＜0.05），中剂量组具有极显著影响（P＜0.01）。在雄性小鼠中，低、中剂量组较空白对照组有显著性影响（P＜0.05），高剂量组较空白对照组有极显著性影响（P＜0.01）。同时研究结果还显示，人参玛咖片剂量组会刺激游泳后雌雄小鼠体内性激素的分泌。根据“保健食品功能学评价程序和检验方法”中抗疲劳实验结果判定规则：“1项以上（含1项）运动试验和2项以上（含2项）生化指标结果阳性，即可判定该受试样品具有抗疲劳的作用。”综合以上实验结果，说明人参玛咖片能够提高小鼠的运动耐力及缓解体力疲劳的功效。

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Study on Anti-fatigue Effects of Panax ginseng Lepidium meyenii Tablet

WANG Xue1，ZHANG Xin-rui1，AN Sheng-shu1，WU Hong-hong1，JIANG Xue1，KANG Jie2，HUA Zheng-jie2，ZHANG Xin-yuan3，ZHOU Yu-lin1，*
（1.School of Life Sciences，Jilin University，Changchun 130012，Jilin，China；2.Tonghua Baiquan Health Food Co.，Ltd.，Tonghua 134000，Jilin，China；3.Institute of Japanese Studies of Jilin Academy of Social Sciences，Changchun 130033，Jilin，China）

Anti-fatigue effects of Panax ginseng Lepidium meyenii（PL）tablet was studied by exercise mice model experiment.Mice were randomly divided into 3 groups：low-dose，medium-and high-dose PL tablettreated groups and control group.Autonomic activities number，rotating time，running time and exhaustive swimming time were determined to evaluate the endurance effect of PL tablet，the levels of adenosine triphosphate（ATP），total superoxide dismutase（T-SOD），glutathione reductase（GSH-Px）and the content of testosterone（T），estradiol（E2）and progesterone（PROG）before and after swimming immediately in blood and liver samples were detected to reaserch the anti-fatigue mechanism of PL tablet.Autonomic activity test showed that PL tablet did not damage the central nervous system of mice.Compared with the control group，PL tablet significantly prolonged the time of rod，endurance and weight-bearing swimming.PL tablet significantly increased ATP levels in serum after swimming compared with the control group，as well as significantly increased T-SOD and GSH-Px levels in serum and liver compared with the control group，PL tablet significantly improved the sexhormone T and PROG levels of male and female mice.Combined with the above experimental results，it can be concluded that PL tablet had improved exercise tolerance and relieve fatigue effect，this may be related to its inhibition effect on lipid peroxidation.，this may be related to its inhibition effect on lipid peroxidation.

Panax ginseng Lepidium meyenii tablet（PL）；anti-fatigue；sex hormone；mice

2016-11-24

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.18.039

吉林省重大科技招标专项（20150203002NY）

王雪（1990—），女（汉），博士研究生，主要从事微生物与生化药学研究。

*通信作者：周毓麟（1982—），男（汉），工程师，研究方向：微生物与生化药学。