黄刺玫果提取物体外抗氧化活性研究

任婧，杨官娥，柴秋彦，卫罡，王进东，*

（1.山西医科大学药学院，山西太原030001；2.山西省医药与生命科学研究院，山西太原030006）

黄刺玫果提取物体外抗氧化活性研究

任婧1，杨官娥1，柴秋彦2，卫罡2，王进东2，*

（1.山西医科大学药学院，山西太原030001；2.山西省医药与生命科学研究院，山西太原030006）

为比较黄刺玫果醇提物不同极性萃取部分的体外抗氧化活性。以抗坏血酸为阳性对照，采用DPPH自由基清除法、邻苯三酚自氧化法和邻二氮菲亚铁法，测定果实提取物不同极性萃取部分对DPPH自由基（DPPH·）、超氧阴离子自由基（O2-·）、羟基自由基（·OH）的清除能力；采用亚硝酸钠-硝酸铝方法测定总黄酮含量，福林-酚方法测定多酚含量。结果表明：黄刺玫果醇提物的不同极性萃取物均有一定的抗氧化能力，并且在一定质量浓度范围内，清除自由基的能力与其质量浓度呈正相关性。其中乙酸乙酯部分对DPPH·、·OH、O2-·的清除能力最强，IC50分别是18.52、737.00、605.50 μg/mL。总黄酮含量和多酚含量测定结果表明，乙酸乙酯部分总黄酮含量和多酚含量最高，分别为15.51%和26.59%。不同极性部分中总黄酮和多酚所起的抗氧化作用相当（R2黄酮在0.98～0.37之间，R2多酚在0.98～0.37之间）。果实粗提物乙酸乙酯萃取部分是一种很有潜力的抗氧化剂，可以进一步开发利用为抗氧化保健食品。

黄刺玫果；抗氧化活性；自由基；含量测定

黄刺玫果是蔷薇科蔷薇属落叶灌木黄刺玫Rosa xanthina Lindl.的干燥成熟果实，广泛分布于我国北方各省的山区和丘陵地带[1]，黄刺玫果中含有大量维生素及黄酮类物质[2]。据记载黄刺玫果具有理气活血，调经健脾的作用，民间也有人在秋冬将其做成果酱来食用，以提高免疫力。

本课题组拟将黄刺玫果开发成一种保健食品，前期对黄刺玫果总黄酮进行了提取，并对提取工艺进行了优化，利用大孔树脂纯化黄刺玫果中总黄酮[3-4]。本文对黄刺玫果粗提物的石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇不同极性部分，采用DPPH自由基清除法、邻苯三酚自氧化法和邻二氮菲亚铁法分别测定其自由基清除能力，并对不同极性部分进行总黄酮类及多酚类化合物含量测定，并对不同极性部分抗氧化活性与总黄酮和多酚含量相关性进行分析。黄刺玫果不同极性部位抗氧化活性的筛选及抗氧化活性物质的探究，为黄刺玫果进一步被开发利用为保健食品提供科学依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

1.2 材料与试剂

黄刺玫果：采自山西省左权县，经由王进东教授鉴定确认为黄刺玫果实；DPPH试剂（1.1-二苯基-2-苦肼基）：东京化成工业株式会社分装，梯希爱（上海）工业发展有限公司；芦丁对照品（质量分数为95%，批号：120721）、没食子酸对照品（质量分数为95%，批号：110831）：中国食品药品研究检定院；福林酚试剂（生化试剂BR）：国药集团化学试剂有限公司；碳酸钠、石油醚（30℃～60℃）、氯仿、正丁醇、乙酸乙酯、无水乙醇等试剂：分析纯，天津市申泰化学有限公司。

2 方法

2.1 黄刺玫果实不同极性萃取物的制备

将黄刺玫干果粉碎，以70%的乙醇为提取溶剂，料液比为 1 ∶10（g/mL），回流提取 3 次，每次 1.5 h，提取液减压浓缩至无醇味[4]。依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，萃取液分别减压浓缩至干燥，得到石油醚部分、氯仿部分、乙酸乙酯部分、正丁醇部分和水部分的干燥品，分别记为样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ。

2.2 体外抗氧化活性测定

2.2.1 样品清除DPPH·能力测定

样品配置：以二甲基亚砜（DMSO）为溶剂，将样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ稀释成浓度为 500、400、300、200、100 μg/mL溶液；将样品Ⅲ稀释成浓度为 400、200、100、50、25、12、6、3 μg/mL 溶液，将样品Ⅳ稀释成浓度为 400、200、100、50、25 μg/mL 溶液。以水为溶剂，将抗坏血酸稀释成浓度为 7.5、5、2.5、1.875、1.25、0.625 μg/mL 溶液。

按照文献[5]配置DPPH自由基工作液，以抗坏血酸为阳性对照。每个质量浓度平行测定3次，取其平均值，计算样品对DPPH自由基的清除率和半数抑制率。

自由基清除率 CR/%=[1-（As-Ab）/Ac]×100

式中：As为未加入DPPH试剂时样品溶液吸光度；Ac为加入DPPH试剂后空白对照吸光度；Ab为加入DPPH试剂后样品溶液吸光度。

（2）水稳碎石混合料拌制。正式拌和生产前应进行试拌，确保混合料级配与含水率符合设计与规范要求。拌和站应严格按照实验室提供配合比进行拌和，出料时应对混合料配合比进行抽样检测，所拌制的水泥稳定碎石混合料应粗细均匀，色泽一致，无结团。

2.2.2 样品清除·OH能力测定

样品溶液的配置：以DMSO为溶剂，将样品Ⅰ稀释成浓度为 6 000、4 500、3 000、2 250、1 500、1 000、750 μg/mL溶液；样品Ⅱ稀释成浓度为5 000、3 750、2 500、1 875、1 250、625 μg/mL 溶液；样品Ⅲ稀释成浓度为 2 000、1 500、1 000、750、500、250、125 μg/mL 溶液；样品Ⅳ稀释成浓度为 3 000、2 250、1 500、1 125、750、375 μg/mL溶液；样品Ⅴ稀释成浓度为 7 500、5 000、2 500、1 875、1 250、625 μg/mL 溶液；以水为溶剂，将抗坏血酸稀释成浓度为 750、500、375、250、187、125、62.5 μg/mL 溶液。

按照文献[6]配置羟基自由基工作液，以抗坏血酸为阳性对照。每个质量浓度平行测定3次，取其平均值计算样品对·OH的清除率和半数抑制率。

自由基清除率CR/%=[1-（A样未损-A样损）/（A对未损-A对损）]×100

式中：A样未损为加样品但不加H2O2溶液的吸光度值；A样损为加样品和H2O2溶液的吸光度值；A对未损为未加样品和H2O2溶液的吸光度值；A对损为未加样品但加H2O2溶液的吸光度值。

2.2.3 样品清除O2-·能力测定

样品溶液的配置：以DMSO为溶剂，将样品Ⅰ稀释成浓度为 6 000、4 000、2 000、1 000、500 μg/mL 溶液；样品Ⅱ稀释成浓度为 2 000、1 000、750、500、250、125 μg/mL 溶液；样品Ⅲ稀释成浓度为 1 000、750、500、250、125 μg/mL溶液；样品Ⅳ稀释成浓度为 2 250、1 500、750、375、185 μg/mL 溶液；样品Ⅴ稀释成浓度为6 000、4 500、3 000、1 500、1 000、500 μg/mL 溶液；以水为溶剂，将抗坏血酸稀释成浓度为 80、70、60、50、40、30、20、10 μg/mL 溶液。

按照文献[7]配置O2-·工作液，以抗坏血酸为阳性对照，每个质量浓度平行测定3次，取其平均值，计算样品对O2-·的清除率和半数抑制率。

以吸光度（A）为Y轴、以时间（min）为X轴做散点图，线性拟合得到回归方程，每分钟吸光度的增量△A即为邻苯三酚自氧化速率。

自由基清除率 CR/%=（△A邻苯三酚-△A样品）/△A邻苯三酚×100

式中：△A邻苯三酚为不加样品的邻苯三酚自氧化速率；△A样品为加样品的邻苯三酚自氧化速率。

2.3 测定不同极性部分总黄酮及多酚类化合物含量

2.3.1 测定总黄酮含量

标准曲线的绘制[8]：取芦丁对照品约20 mg，精密称定，置于50 mL容量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，得到芦丁对照品溶液。精密吸取芦丁对照品溶液 0.5、1、1.5、2、3、4 mL，分别置于 25 mL 容量瓶中，加30%乙醇至总体积6.0 mL；分别加入5%亚硝酸钠溶液1 mL，摇匀，放置6 min，加入10%硝酸铝溶液1 mL，放置6 min，加入1 mol/L氢氧化钠10 mL，摇匀，加30%乙醇至刻度，放置15 min。以1.0 mL 30%乙醇代替样品溶液，作为空白，扫描200 nm～700 nm，选定最大吸收波长为500 nm，得到标准曲线A=0.011 8C+0.001 1（r=0.999 7，n=6）。

样品溶液的配置：取样品Ⅰ3份，每份约500 mg，精密称定，置于5 mL容量瓶中，无水乙醇溶解并稀释至刻度，得供试品溶液1。取样品Ⅱ3份，每份约150mg，精密称定，置于5mL容量瓶中，无水乙醇溶解并稀释至刻度，得供试品溶液2；取样品Ⅲ3份，每份约25 mg，精密称定，置于5 mL容量瓶中，无水乙醇溶解并稀释至刻度，得供试品溶液3；分别取样品Ⅳ、Ⅴ各3份，每份约150 mg，精密称定，置于5 mL容量瓶中，70%乙醇溶解并稀释至刻度，得供试品溶液4和供试品溶液5。

样品溶液测定：分别精密吸取1.0 mL供试品溶液，置于25 mL容量瓶中，加30%乙醇至总体积6.0 mL；分别加入5%亚硝酸钠溶液1 mL，摇匀，放置6 min，加入10%硝酸铝溶液1 mL，放置6 min，加入1 mol/L氢氧化钠10 mL，摇匀，加30%乙醇至刻度，放置15 min。在500 nm处测定吸光光度值。

2.3.2 测定多酚类化合物含量

标准曲线的绘制[9]：取没食子酸对照品约4 mg，精密称定，置于50 mL容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，得没食子酸对照品溶液。精密吸取没食子酸对照品溶液 0.5、1、1.5、2、2.5、3 mL，分别置于 25 mL 容量瓶中，分别加入1.0 mL福林-酚溶液，放置5 min后，分别加入5 mL 10%碳酸钠溶液，最后加蒸馏水至刻度，30℃暗处放置1 h。以1.0 mL蒸馏水代替样品溶液，作为空白，扫描400 nm～900 nm，选定最大吸收波长为744 nm，得到标准曲线为A=0.003 8C+0.044 1（r=0.999 7，n=6）。

样品溶液的配置：取样品Ⅰ3份，每份约32.5 mg，精密称定，置于5 mL容量瓶中，无水乙醇溶解并稀释至刻度，得供试品溶液1。取样品Ⅱ3份，每份约12.5 mg，精密称定，置于5 mL容量瓶中，无水乙醇溶解并稀释至刻度，得供试品溶液2；取样品Ⅲ3份，每份约5 mg，精密称定，置于10 mL容量瓶中，无水乙醇溶解并稀释至刻度，得供试品溶液3；取样品Ⅳ部分3份，每份约10 mg，精密称定，置于5 mL容量瓶中，70%乙醇溶解并稀释至刻度，得供试品溶液4；取样品Ⅴ3份，每份约12.5 mg，精密称定，置于5 mL容量瓶中，70%乙醇溶解并稀释至刻度，得供试品溶液5。

样品溶液的测定：分别精密吸取供试品溶液1.0 mL，置于25 mL容量瓶中，分别加入1.0 mL福林-酚溶液，放置5 min后，分别加入5 mL 10%碳酸钠溶液，最后加蒸馏水至刻度，30℃暗处放置1 h。在744 nm处测定吸光度值。

3 结果与分析

3.1 体外抗氧化清除自由基试验结果

黄刺玫果醇提物的不同极性萃取物清除DPPH·的能力见图1；清除·OH的能力见图2；清除O2-·的能力见图3；表1为不同极性部分样品和阳性对照清除DPPH·、·OH、O2-·的半数清除率（IC50）。

图1 黄刺玫果醇提物的不同极性萃取物对DPPH·的清除作用Fig.1 The DPPH·scavenging activity of the different polar extracts of Rose xanthina Lindl.fruit

图2 黄刺玫果醇提物的不同极性萃取物对·OH自由基的清除作用Fig.2 The·OH scavenging activity of the different polar extracts of Rose xanthina Lindl.fruit

由图1～图3中我们可以看出：黄刺玫果醇提物的不同极性部分萃取物DPPH·、·OH、O2-·均有一定的清除能力，清除自由基能力与不同极性萃取质量浓度之间显示良好的量效关系，随着不同极性萃取物质量浓度的增大，其抗氧化能力也相应升高。在一定质量浓度范围内，其清除自由基的能力与质量浓度呈线性关系，当达到一定质量浓度时，其清除自由基的曲线趋于平衡。

图3 黄刺玫果醇提物的不同极性萃取物对O2-·自由基的清除作用Fig.3 The O2-·scavenging activity of the different polar extracts of Rose xanthina Lindl.fruit

表1 黄刺玫果提取物对DPPH·、·OH、O2-·的清除作用（IC50）Table 1 The effect on scavenging DPPH·，·OH，O2-·of extract of Rose xanthina Lindl.fruit

由表 1 可知，各样品对 DPPH·、·OH、O2-·均有一定的清除能力，乙酸乙酯部分抗氧化能力最强，清除、·OH、O2-·的 IC50值分别是 18.52，737.00、605.50 μg/mL。不同极性部分清除DPPH·、·OH的能力大小依次是Ⅲ＞Ⅱ＞Ⅳ＞Ⅰ＞Ⅴ，清除O2-·的能力大小依次是Ⅲ＞Ⅳ＞Ⅱ＞Ⅰ＞Ⅴ。

3.2 不同极性萃取部分总黄酮和多酚类化合物含量

不同极性萃取部分总黄酮和多酚含量见表2。

由表2可知，在所有不同极性萃取部分中，乙酸乙酯部分含有的总黄酮和多酚含量最高，分别是15.51%和26.59%。

3.3 不同极性部分抗氧化活性与总黄酮和多酚含量相关性分析

由上述结果可知，不同的极性部分和阳性对照抗坏血酸都显示出良好的量效关系，其中阳性对照具有最强的活性，抗坏血酸清除DPPH·、·OH、O2-·的IC50分别是 8.67、327.40、51.46 μg/mL，将抗坏血酸 IC50与不同极性萃取物清除 DPPH·、·OH、O2-·的 IC50进行换算，即得以抗坏血酸表示的不同极性萃取物的活性强度（相当于抗坏血酸，μg/μg），将以抗坏血酸表示的不同极性部分清除DPPH·、·OH、O2-·的活性强度与不同极性萃取物多酚和总黄酮含量分别进行相关性分析，见图4。

表2 黄刺玫果提取物不同极性萃取部分总黄酮和多酚含量Table 2 Content of the total flavonoids and ployphenols in different polar extracts of Rose xanthina Lindl.fruit

图4 不同极性部分抗氧化活性与总黄酮和多酚含量相关性Fig.4 Related coefficient between antioxidant ability and polyphenol contents，flavonoid contents

以R2的大小表示相关性强弱，总黄酮和多酚含量与DPPH·、O2-·的清除能力均呈正相关，对DPPH·而言，总黄酮含量与多酚含量效果相当具有显著的相关性（R2黄酮=0.985 8，R2多酚=0.9874），对·OH 而言，总黄酮与多酚含量效果相当，但相关性较弱（R2黄酮=0.379 5，R2多酚=0.377 4），对 O2-·而言，总黄酮含量效果略高于多酚含量二者均具有较显著的相关性（R2黄酮=0.903 9，R2多酚=0.815 9）。

4 讨论

自由基是机体抗氧化反应中产生的有害物质，性质活泼，氧化能力强，其对机体的攻击，可能诱发多种疾病[10]。自由基不仅来源于人体内，也来源于体外，降低自由基对人体的损害也有两种方法。第一利用内源性自由基系统清除体内多余自由基；其次发掘天然抗氧化剂—自由基清除剂，阻断自由基对人体的入侵。在对总黄酮类化合物和多酚类化合物的研究中，有许多报道表明总黄酮化合物及多酚化合物具有良好的抗氧化能力。本试验结果表明，黄刺玫果部分萃取物清除DPPH·的能力较清除O2-·和·OH的能力强，但总体来说，黄刺玫果仍显示了较好的体外抗氧化活性。黄刺玫果醇提物的乙酸乙酯萃取部分清除自由基能力最强，该部分清除DPPH·、·OH和O2-·的IC50分别是18.52，737.00和605.50 μg/mL。这可能是该部分中所含黄酮类化合物与总多酚类化合物的作用。该部分分别以芦丁、没食子酸为对照品，采用紫外-可见分光光度法测定不同极性萃取部分的总黄酮及多酚含量，通过测定结果可知，乙酸乙酯部分总黄酮和多酚含量最高，可达15.51%和26.59%。从不同极性部分总黄酮含量和多酚含量与活性相关性分析，DPPH·、·OH和O2-·的抗氧化活性均与总黄酮和多酚含量呈显著正相关（R2黄酮在 0.98～0.37之间，R2多酚在 0.98～0.37之间），总体而言，总黄酮和多酚所起抗氧化作用相当。与由此更进一步证实了我们的推测，乙酸乙酯部分的抗氧化作用可能来源于总黄酮和多酚类化合物。从以上试验结果可知，黄刺玫果尤其是乙酸乙酯部分是一种优良的天然抗氧化剂，但是对于乙酸乙酯部分的总黄酮和多酚成分应该进行进一步的富集，以便对下一步研究和开发黄刺玫果实抗氧化保健食品提供充分的实验依据。

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Study on the Antioxidant Activity of Extract of Rose xanthina Lindl.Fruit in vitro

REN Jing1，YANG Guan-e1，CHAI Qiu-yan2，WEI Gang2，WANG Jin-dong2，*
（1.College of Pharmacy，Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，Shanxi，China；2.Shanxi Institute of Medicine and Life Science，Taiyuan 030006，Shanxi，China）

To study the antioxidant activity of the different polarities of ethanol extract of fruit from Rose xanthina Lindl.in vitro.The antioxidant activity was measured with the methods of DPPH·scavenging，pyrogallol autoxidation and phenanthroline by using ascorbic acid as the positive control.Measured total flavonoids in the ethyl acetate with the methods of Sodium nitrite-aluminium nitrate chromogenic，phenolic compounds determine by Foline-reagent method.The results showed that the extracts had some certain.antioxidant activity，and exhibited a concentration-dependent radical scavenging activity in a certain concentration range.Different ploarities had different ability of scavenging free radical，in which the ethyl acetate fraction of the fruit had the most potent free radical scavenging activity on DPPH·，O2-·，·OH，with IC5018.52，737.00，605.51 μg/mL，respectively.Furthermore the ratio of the total flavoroids in the ethyl acetate fraction of the fruit was 15.50%and the phenolic compounds was 26.59%.The flavonoids and polyphenols of different polarity had the same effect on antioxidant（R2黄酮and R2多酚were between 0.98-0.37）.The ethyl acetate of the fruit is a potential natural antioxidant，It also can be further development and utilization of antioxidant functional food.

rose xanthina Lindl.fruit；antioxidant activity；free radical；content determination

2016-12-21

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.18.003

山西省国际基金中美合作项目（2014081049-2）

任婧（1991—），女（汉），硕士研究生，研究方向：天然产物保健食品开发。

*通信作者：王进东（1964—），男（汉），教授级高工，研究方向：天然产物保健食品开发。