响应面优化纤维素酶提取广陈皮中橙皮苷工艺

张利，黄敏，王婷，潘国栋，余楚纯，李立群，叶金玉

（深圳市味奇生物科技有限公司，广东 深圳 518109）

响应面优化纤维素酶提取广陈皮中橙皮苷工艺

张利，黄敏，王婷，潘国栋，余楚纯，李立群，叶金玉

（深圳市味奇生物科技有限公司，广东 深圳 518109）

为优化纤维素酶辅助提取广陈皮中橙皮苷的工艺条件，选定加酶量、pH值、温度和时间为主要影响因素，在单因素试验的基础上，采用响应面分析法优化了纤维素酶的提取条件。结果表明，纤维素酶的最佳作用条件为：加酶量0.8%，pH值3.45，温度59℃，时间2 h，在此条件下，橙皮苷得率达到了（4.13±0.06）%，较传统醇提工艺提高了11.32%。

广陈皮；纤维素酶；橙皮苷；响应面法

陈皮为芸香科植物橘Citrus reticulata Blanco及其栽培变种的干燥成熟果皮，陈皮药材分为“陈皮”和“广陈皮”[1]。“广陈皮”为茶枝柑的干燥成熟果皮，主产于广东新会，是广东十大地道药材之一。陈皮和广陈皮的有效成分有挥发油和黄酮类物质（其中以橙皮苷为主），一般通过测定橙皮苷的含量作为评价陈皮的质量指标。

橙皮苷属双氢黄酮糖苷类化合物，是陈皮的主要成分之一。研究发现，橙皮苷具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗癌、调节免疫力、防辐射、保护心血管系统等多种药理活性[2]，且作为天然活性物质，其无毒副作用，可以用作食品、药品等的天然添加剂，在食品、医药及日用化工行业有着广泛的应用。目前，陈皮中橙皮苷提取常用的方法有水提法和有机溶剂浸提法。然而，陈皮中的橙皮苷几乎被以纤维素为主构成的细胞壁所包围，传统的提取方法无法使细胞壁破裂，存在巨大的传质阻力，致使提取效果不理想，提取率低，资源浪费严重。而纤维素酶能够作用于天然和结晶的纤维素，可将纤维素分解成寡糖或单糖。采用纤维素酶可以破坏植物细胞壁结构，使细胞壁疏松、破裂，减小传质阻力，有利于陈皮中橙皮苷的溶出，从而提高橙皮苷的提取率[3-5]。因此，本研究建立纤维素酶辅助提取法，并采用响应面法优化酶解工艺，以期提高橙皮苷提取率，为进一步开发利用广陈皮提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

广陈皮：广东药材公司中药饮片厂；橙皮苷标准品（色谱纯，批号110712）：广州药品检验所；纤维素酶（15 000 U/g）：国药集团化学试剂有限公司；无水乙醇（分析纯）、冰乙酸（优级纯）：天津市大茂化学试剂厂；甲醇（色谱纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

ME204E电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；HHS-6S电子恒温不锈钢水浴锅：上海虞龙仪器设备有限公司；JJ-1增力电动搅拌器：江苏城西晓阳电子仪器厂；GM-0.33A隔膜真空泵：天津市津腾实验设备有限公司；HS6150超声清洗机：北京康林科技有限公司；LC-20高效液相色谱仪：日本岛津公司。

1.3 方法

1.3.1 橙皮苷标准曲线的绘制

精确称取橙皮苷标准品，用甲醇配制成浓度为0.4 mg/mL的标准溶液，作为储备液。然后取储备液1、2、4、6、8、10 mL，分别定容至 10 mL，使橙皮苷浓度分 别 为 0.04、0.08、0.16、0.24、0.32、0.40 mg/mL 的 溶液，采用高效液相色谱，绘制橙皮苷标准曲线。以橙皮苷浓度（Y）对峰面积（X）进行线性回归，得到回归方程 Y=5.654 36×10-8X+0，R2=0.999 2，表明橙皮苷浓度在0.04 mg/mL～0.40 mg/mL时与峰面积值的线性关系良好。

色谱条件：色谱柱为安捷伦公司ZORBAX Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇∶醋酸 ∶水=35∶4 ∶61；检测波长：283 nm；流速：0.5 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：5 μL。

1.3.2 纤维素酶辅助提取工艺

取广陈皮原料置于60℃恒温干燥箱中干燥4 h，粉碎，过80目筛。准确称取6.0 g广陈皮粉末，按一定料液比加入蒸馏水[料液比 1∶10（g/mL）]，调节溶液pH值，然后加入纤维素酶在一定温度下反应一段时间。酶解反应结束后，在本课题组醇提结果的基础之上，加入乙醇继续提取 [提取条件为料液比1∶30（g/mL）、乙醇浓度65%、温度83℃、提取时间2 h]，冷却，抽滤，洗涤滤渣，合并滤液与洗液，采用高效液相色谱仪分析检测提取液中的橙皮苷。根据橙皮苷标准曲线得出提取液中橙皮苷的含量，并按下式计算广陈皮橙皮苷得率：

1.3.3 单因素试验

根据试验设计，按照不同的加酶量、pH值、温度、时间进行广陈皮中橙皮苷的纤维素酶法辅助提取，以橙皮苷得率为指标，确定最佳酶解条件。

1.3.4 响应面分析法优化试验

在单因素试验的基础上，采用响应面设计，运用Box-Behnken试验设计原理，选定加酶量、pH值、温度、时间为因素，以橙皮苷得率为响应值，设计四因素三水平的响应面分析试验确定纤维素酶法辅助提取的最佳条件。并使用Design-Expert 7.0.1.0软件对设计方案中每次试验获得的响应值进行多维非线性回归分析，求出多元二次方程的系数，方程拟合的质量用回归系数R2表示，其统计显著性用F-检验法进行检验。

2 结果与分析

2.1 加酶量对橙皮苷得率的影响

称取6 g广陈皮置于带盖的250 mL三角瓶中，按料液比1∶10（g/mL）加入蒸馏水，调节溶液的pH值至4.5，分别加入0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的纤维素酶在50℃下反应2 h。酶解反应结束后加入乙醇继续提取（提取条件为料液比1∶30（g/mL）、乙醇浓度65%、温度83℃、提取时间2 h），冷却，抽滤，测定提取液中的橙皮苷，考察不同加酶量对橙皮苷得率的影响，结果见图1。

由图1分析可知，随着加酶量的增加，橙皮苷得率增加，但当加酶量达到0.8%后，橙皮苷得率随着加酶量的增加反而下降。这是因为陈皮作为固体底物，不能充分扩散到溶液中，导致酶与底物的接触面积受到限制。在较低的酶浓度下，酶与底物尚可较充分地结合；随着酶浓度的升高，底物浓度不能对酶达到饱和，导致酶的作用受到抑制[6]。因此，对一定的底物浓度均存在一个最佳酶用量，试验选择适宜加酶量为0.8%。

图1 加酶量对橙皮苷得率的影响Fig.1 Influence of enzyme amount on the yield of hesperidin

2.2 pH值对橙皮苷得率的影响

称取6 g广陈皮置于带盖的250 mL三角瓶中，按料液比1∶10（g/mL）加入蒸馏水，调节溶液的pH值分别为 3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5，加入 0.8%的纤维素酶在50℃下反应2 h。酶解反应结束后加入乙醇继续提取2 h，冷却，抽滤，测定提取液中的橙皮苷，考察不同pH值对橙皮苷得率的影响，结果见图2。

图2 pH值对橙皮苷得率的影响Fig.2 Influence of pH on the yield of hesperidin

由图2分析可知，当溶液pH值小于3.5时，橙皮苷得率随着pH值的增大而增大，当pH值达到3.5时橙皮苷得率达到最大值，此后橙皮苷得率逐渐下降。这是因为pH值影响酶的活性中心或与之有关的基团的解离状态，酶解反应有着适宜的pH值，在此pH值条件下酶解催化速率最高。pH值在3.5左右时正好处于纤维素酶的最佳作用pH值区间内，能够发挥纤维素酶的最大活力，破坏细胞壁，减小传质阻力，促进橙皮苷的溶出[7]。因此，试验选择适宜pH值为3.5。

2.3 温度对橙皮苷得率的影响

称取6 g广陈皮置于带盖的250 mL三角瓶中，按料液比1∶10（g/mL）加入蒸馏水，调节溶液的pH值至3.5，加入 0.8%的纤维素酶，分别在 45、50、55、60、65、70℃条件下反应2 h。酶解反应结束后加入乙醇继续提取2 h，冷却，抽滤，测定提取液中的橙皮苷，考察不同温度对橙皮苷得率的影响，结果见图3。

图3 温度对橙皮苷得率的影响Fig.3 Influence of temperature on the yield of hesperidin

由图3分析可知，在温度低于60℃时，橙皮苷得率随着温度的升高而增大；温度超过60℃时，橙皮苷得率逐渐下降。酶解反应有着适宜的反应温度，温度过低，酶活力也较低，不能充分发挥酶解作用效果；升高温度增加了包括酶和底物分子在内的溶液体系的热能，既可使胞内活性物质分子运动速度加快，又能提供酶促反应所需的能量，使酶解破壁作用加强，提高橙皮苷得率；但温度升高将使酶部分甚至全部变性，酶解反应受到抑制，导致橙皮苷得率下降。因此，试验选择适宜温度为60℃。

2.4 时间对橙皮苷得率的影响

称取6 g广陈皮置于带盖的250 mL三角瓶中，按料液比1∶10（g/mL）加入蒸馏水，调节溶液的pH值至3.5，加入0.8%的纤维素酶，在60℃条件下分别反应1.0、1.5、2.0、2.5、3 h。酶解反应结束后加入乙醇继续提取2 h，冷却，抽滤，测定提取液中的橙皮苷，考察不同提取时间对橙皮苷得率的影响，结果见图4。

图4 时间对橙皮苷得率的影响Fig.4 Influence of time on the yield of hesperidin

由图4分析可知，随着反应时间的增加，橙皮苷得率逐渐增大。随着酶解反应的进行，广陈皮细胞壁及细胞间层的纤维素和果胶形成的阻挡层被有效降解，橙皮苷逐渐从细胞内扩散出来。但随着反应的进行，细胞内外的橙皮苷浓度达到了一种动态平衡，继续延长提取时间对提高提取液中橙皮苷浓度的作用有限，且酶解反应产物浓度的积累也将抑制酶解反应的进行[8]，此外时间过长将延长生产周期，增加能耗，不利于工业化生产。因此试验选择适宜时间为2 h。

2.5 响应面法优化纤维素酶辅助提取条件

为了进一步优化纤维素酶辅助提取条件，以橙皮苷得率为响应值，应用Design-Expert 7.0.1.0软件中的Box-Behnken设计四因素三水平的响应面分析试验，共设计27个处理组，其中3个零水平处理组，试验因素和水平见表1，响应面分析试验结果见表2。

表1 试验因素和水平Table 1 Test factors and levels

表2 试验设计及结果Table 2 Design of experiments and results

运用Design-Expert 7.0.1.0软件进行二次多元回归拟合，得到橙皮苷得率（Y）对加酶量（A）、pH（B）、温度（C）、时间（D）的回归模型为：

Y=4.12-0.022A-0.055B-0.15C+0.12D+0.025AB+0.015AC-0.020AD-0.008BC-0.008BD+0.047CD-0.26A2-0.26B2-0.38C2-0.21D2

对该模型进行方差分析，结果见表3。

表3 回归模型方差分析表Table 3 Variance analysis table of regression model

由方差分析可知，模型的F=54.37，P＜0.000 1，回归模型达到极显著，二次多元回归模型成立，应用此方程可以预测橙皮苷得率及优化酶解提取工艺。失拟分析表明，失拟项P=0.525 8＞0.05，模型失拟度不显著，因而该模型拟合程度比较好，试验误差小，可以用此模型对橙皮苷提取进行分析和预测。

回归方程的拟合程度可通过决定系数R2和R2校正值R2adj来验证，模型的预测值与试验真实值之间的相关性达98.45%，R2adj为0.966 4，表明在橙皮苷提取工艺研究中，该模型能解释96.64%响应值的变化，因而该模型拟合程度良好。

一次项 C、D 和二次项 A2、B2、C2、D2的 P＜0.000 1，表明 C、D 和 A2、B2、C2、D2对橙皮苷得率的影响是极显著的；一次项B的P＜0.05，表明B对橙皮苷得率有显著影响。而一次项 A、交互项 AB、AC、AD、BC、BD、CD的P＞0.05，表明其对橙皮苷得率没有显著性影响。在试验考察范围内，各因素对橙皮苷得率的影响主次顺序为：温度＞时间＞pH值＞加酶量。

运用Design-Expert 7.0.1.0软件对表4数据进行二次多元回归拟合，所得到的二次回归方程的响应面及其等高线见图5～图10。

图5 加酶量和pH值的交互作用Fig.5 Interactions of enzyme amount and pH

图6 加酶量和温度的交互作用Fig.6 Interactions of enzyme amount and temperature

图7 加酶量和时间的交互作用Fig.7 Interactions of enzyme amount and time

从以上6组图可以看出，橙皮苷得率随着各因素的增加呈现先增大后减小的趋势，但时间的减小趋势不明显，加酶量的变化趋势不及pH值、温度和时间，加酶量的影响最小。pH值、温度和时间对橙皮苷得率的影响均很显著，这与响应面分析结果一致。

图8 pH值和温度的交互作用Fig.8 Interactions of pH and temperature

图9 pH值和时间的交互作用Fig.9 Interactions of pH and time

图10 温度和时间的交互作用Fig.10 Interactions of temperature and time

利用Design-Expert 7.0.1.0软件，根据响应面试验数据得出橙皮苷得率最高时的最佳工艺条件为：加酶量0.79%、pH3.45、温度59.07℃、时间2.13 h。此时，响应面预测橙皮苷得率为4.15%。但考虑到实际生产情况，可将加酶量0.8%、pH3.45、温度59℃、时间2 h作为最佳生产工艺参数。在橙皮苷得率最高时对应的最佳提取条件下进行验证试验，得到广陈皮中橙皮苷得率为（4.13±0.06）%（n=3），与模型的预测值基本一致。此外，采用纤维素酶辅助提取所得橙皮苷得率比传统的乙醇提取工艺（橙皮苷得率为3.71%）提高了11.32%。

3 结论

为提高广陈皮中橙皮苷的提取效率，优化纤维素酶酶解工艺条件，以加酶量、pH值、温度和时间为主要影响因素，以橙皮苷得率为评价指标，在单因素试验的基础之上，采用四因素三水平的响应面分析试验对纤维素酶辅助提取广陈皮中橙皮苷的工艺进行了优化。结果表明：最佳酶解工艺条件为加酶量0.8%、pH3.45、温度59℃、时间2 h，在此条件下测得橙皮苷得率为（4.13±0.06）%，较传统醇提工艺提高了11.32%。采用响应面法确定的纤维素酶提取工艺合理，该工艺可以用于广陈皮中橙皮苷的提取。

[1] 国家药典委员会．中华人民共和国药典2015年版一部[M]．北京:中国医药科技出版社,2015:191

[2] 钱俊臻,王伯初．橙皮苷的药理作用研究进展[J]．天然产物研究与开发,2010,22(1):176-180

[3] 肖更生,万利秀,陈于陇,等．纤维素酶-甲醇协同提取柑橘皮总黄酮的条件优化[J]．广东农业科学,2012(24):97-100

[4] 曾柏全,周小芹,解西玉．纤维素酶-微波法提取脐橙皮橙皮苷工艺优化[J]．食品科学,2010,31(4):85-89

[5] 贾亚伟,丁玉,朱红菊．橙皮苷提取工艺研究进展[J]．中国科技论文在线,2011,6(3):211-214

[6] 苏东林,单杨,李高阳,等．酶法辅助提取柑桔皮总黄酮的工艺优化研究[J]．农业工程学报,2008,24(4):240-245

[7] 吴梅林,周春山,陈龙胜,等．酶法提取银杏黄酮类化合物研究[J]．天然产物研究与开发,2004,16(6):557-560

[8] 张卫红,张效林．复合酶法提取茶多酚工艺条件研究[J]．食品研究与开发,2006,27(11):5-7

Optimization of Extraction Technology of Hesperidin from Citri Reticulatae Pericarpium by Cellulose Using Response Surface Methodology

ZHANG Li，HUANG Min，WANG Ting，PAN Guo-dong，YU Chu-chun，LI Li-qun，YE Jin-yu
（Shenzhen Weicky Biotechnology Co.，Ltd.，Shenzhen 518109，Guangdong，China）

In order to optimize the extraction technology of hesperidin from Citri Reticulatae Pericarpium by cellulose.Enzyme amount，pH，temperature and time were selected as the main influencing factors.The extraction condition of hesperidin by cellulose was optimized by response surface methodology on the basis of single factor experiment.The result showed that the optimum extraction technology were enzyme amount of 0.8%，pH of 3.45，temperature of 59 ℃，time of 2 h.Under these conditions，yield of hesperidin reached（4.13±0.06）%，which increased by 11.32%compared with traditional alcohol extraction technology.

Citri Reticulatae Pericarpium；cellulose；hesperidin；response surface methodology

2016-12-26

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.18.012

深圳市战略新兴产业发展专项资金（CXZZ201406251617 34122）

张利（1983—），女（汉），硕士研究生，研究方向：食品、保健食品的研究与开发。