姜黄素激活自噬对抗ANGⅡ诱导的心肌纤维化发生

赵明 陈锦铷 韩秀敏 武琼 孙英慧

姜黄素激活自噬对抗ANGⅡ诱导的心肌纤维化发生

赵明 陈锦铷 韩秀敏 武琼 孙英慧

目的 探讨姜黄素（CMN）在病理性心肌纤维化炎症中的作用及机制。方法 以血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）作为刺激因子制备小鼠心肌纤维化疾病模型，以不同浓度的CMN（50、100 ng/ml）作为干预浓度进行治疗研究。应用小动物超声检测干预28 d后各组小鼠心功能指标。应用HE和Masson染色方法观察干预28 d后小鼠心肌病理损伤及纤维化情况。应用Western blot方法检测Ⅲ型胶原和自噬相关蛋白（LC3和P62）表达。结果 心功能检测发现，CMN治疗后，可呈剂量依赖性对抗ANGⅡ诱导的小鼠心肌损伤。HE和Masson染色进一步证实，CMN高浓度治疗组小鼠心肌损伤受到抑制，心肌纤维化程度显著减轻，心肌组织Ⅲ型胶原表达显著减少。应用Western blotting证实，CMN干预后，可明显激活小鼠心肌的自噬水平，促进自噬发生。进一步应用自噬抑制剂氯喹干预治疗后，Masson染色提示，CMN对抗ANGⅡ诱导小鼠心肌纤维化作用受到明显抑制，同时，小鼠心肌自噬激活也明显受到抑制。结论 CMN通过激活心肌组织自噬活化对抗ANGⅡ诱导的小鼠心肌纤维化发生。

姜黄素； 心肌纤维化； 自噬

充血性心力衰竭是各种心脏疾病发生发展的终末阶段，发病率高，死亡率高，是目前威胁人类生命健康的重要疾病之一，其主要病因包括冠心病、高血压和结构性心脏病。心力衰竭的发病机制除了神经内分泌系统的过度激活以外，还涉及到心肌组织的重塑，其中肾素-血管紧张素系统的过度激活和心肌纤维化（myocardial fibrosis，MF）是心力衰竭发生、发展的重要阶段。MF是心肌间质重构的结果，与成纤维细胞增生和细胞外基质平衡紊乱密切相关，进而导致心肌纤维排列紊乱，是多种心脏疾病发展到一定阶段的共同病理表现，最终使患者心肌顺应性下降，导致心力衰竭及恶性心律失常的发生，是心血管疾病患者的主要死亡原因。目前，MF的防治研究已经成为国内外的研究热点[1]。近年来大量研究显示，神经-内分泌系统调节机制中的肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）在MF发生发展中起着关键作用，其中心肌纤维化发生的主要原因可能在于血管紧张素Ⅱ（AngiotensinⅡ，AngⅡ）升高引起心肌细胞死亡和心肌成纤维细胞过度增生。姜黄素（curcumin，CMN）是一种天然的多酚类化合物，从姜黄属植物根茎中提取得来，是姜黄属中药最重要的活性成分，通过抑制氧化应激和炎症反应以达到防止心肌损伤的作用。近年来，大量的研究均证实，CMN可显著诱导心、肝、肾和肺等器官的微粒体内血红素加氧酶-1的表达，从而降低相应组织细胞的氧化应激水平，增强上述器官的抗氧化损伤能力。氧化应激损伤是心肌炎症及纤维化发生的重要病理基础，因此，本研究尝试阐明CMN治疗对小鼠心肌纤维化是否具有拮抗作用，并初步阐明其调控机制。

1 材料与方法

1.1 建立小鼠心肌纤维化模型 20只C57BL野生型雄性小鼠，体重15～22 g（沈阳军区总医院实验动物科提供），随机分为CMN不同浓度组、模型组和生理盐水对照组，各5只小鼠。CMN组小鼠采用直接灌胃法给药，分别给予CMN 50 mg·kg-1·d-1和100 mg·kg-1·d-1两种剂量，每日1次，其余各组小鼠给予生理盐水灌胃，喂养1周。除空白对照组外，其余组小鼠均经腹腔注射浓度为3.5%的水合氯醛（10 ml/kg）麻醉，然后皮下埋入置入式胶囊渗透压泵（USA/Alzet生产），内容药物为AngⅡ1.3 mg/kg，泵持续时间为28 d。

1.2 小鼠体重、血压监测，小鼠心脏超声测定及标本采集 给药期间，每周定期监测各组小鼠的血压及体重。血压测试采用小动物血压计，数据收集完毕后再进行统计分析。给药期满后，采用vivo小动物超声观察小鼠的心脏情况，记录其各心腔大小及左心室射血分数，衡量小鼠的心脏功能情况，然后开胸经小鼠左心室采血2 ml，离心取血清用于血脂等相关检测。取用4%多聚甲醛固定的小鼠心脏组织，进行相关HE、Masson、免疫组化等病理组织学检测。

1.3 HE和Masson染色分析心肌纤维化情况 第一步HE染色：Leica石蜡切片机进行连续切片，切片厚度为5 μm。将石蜡切片烘烤2 h（防止脱片）后，常规脱蜡至水，然后应用蒸馏水洗涤 2次，每次洗涤5 min，至无酒精味道。苏木素染色5 min PBS返蓝。显微镜下观察核染效果，可用1%盐酸酒精分色。伊红染色2 min。常规应用梯度酒精脱水二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜观察。

第二步Masson染色：Leica石蜡切片机进行连续切片，切片厚5 μm。石蜡切片常规脱蜡至水，应用蒸馏水清洗2次，每次5 min。然后先用苏木素染色5 min，再用丽春红品红液染5 min。染色完毕后先用0.5%冰醋酸水溶液快速冲洗，再用1%磷钼酸水溶液快速处理，其切片由深红色至鲜红色至粉红色，再用苯胺蓝染色，0.5%冰醋酸水溶液快速冲洗，常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，最后用中性树胶封片，在显微镜下观察。Masson染色下心肌细胞呈红色，胶原呈蓝色。采用MiVnt图像分析系统在10×20倍显微镜下测定心肌胶原容积分数（collagen volumefraction，CVF）。CVF=心肌胶原面积/所测视野面积。每只大鼠选取6张切片，每张切片均随机选取3个视野测量，取平均值。

1.4 免疫组化染色检测心肌胶原蛋白的表达 将心肌组织用4%多聚甲醛室温固定过夜，石蜡包埋后进行切片，切片烘烤过夜。切片脱蜡后，用pH 6.0柠檬酸缓冲液在高压锅内进行抗原修复，自然冷却后PBS洗涤3次，5%山羊血清封闭20 min，弃掉血清加入小鼠Ⅲ型胶原（CollagenⅢ，ColⅢ）单克隆抗体（1∶100），4℃孵育过夜，PBS洗涤3次，加入山羊抗小鼠HRP标记二抗（1∶100），室温避光孵育2 h PBS增加洗涤时间洗涤3次，DAB显色，苏木素复染细胞核，梯度酒精脱水，二甲苯透明，30%中性树脂封片，显微镜下观察、照像。

1.5 Western blot检测心肌相关自噬蛋白的表达取1.2项中心脏组织，每组随机取1例，分别置于玻璃研磨器中，加入RAPI组织细胞裂解液1 ml研磨使组织均匀地分散在裂解液中，4℃温度下放置30 min，每过10 min振摇1次。4℃温度下用12 000 r/min的速度离心20 min，弃除脂层，上清液即组织蛋白提取液。随后用BCA法进行蛋白定量，调整样本浓度一致，各样本上样量25μg/泳道，经10%SDS-PAGE电泳，半干转膜、封闭，分别与第一抗体（1∶300）杂交，4℃下孵育过夜，加入辣根过氧化物酶标记的第二抗体（1∶5000），37℃孵育50～70 min，化学发光、显影、压片，采用Gel pro Analyzer软件计算目的蛋白表达的灰度值。

1.6 统计学方法 数据采用SPSS 10.0软件进行统计学分析。实验结果以±s表示，采用ANOVA行单因素方差分析，组间比较用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组实验鼠心功能指标 小鼠皮下埋泵AngⅡ处理28 d后行vivo超声检测发现，与生理盐水对照组比较，AngⅡ埋泵组小鼠心功能明显减弱，射血分数较低，而CMN组小鼠心功能较AngⅡ心脏射血情况的差异与其心肌状态相关，心肌纤维化会影响小鼠左室射血，故检测其左室收缩期和舒张期容量，并测定左室射血分数，P＜0.05，差异有统计学意义。见表1。

表1 不同治疗组小鼠心功能指标比较（±s）

表1 不同治疗组小鼠心功能指标比较（±s）

注：LV Vol-d：左室舒张期容量；LV Vol-s：左室收缩期容量；EF：左室射血分数

组别 例数 LV Vol-d LV Vol-s EF（%）sham组 5 7.58±1.06 2.24±0.52 88.65±7.29 AngⅡ组 5 40.58±9.06 16.24±6.52 48.65±10.29 CMN-1组 5 27.52±4.81 10.28±4.27 60.44±7.71 CMN-2组 5 16.39±3.26 4.46±7.40 75.13±13.00

2.2 CMN呈剂量依赖性对抗AngⅡ诱导的心肌纤维化 HE染色提示：假手术组心肌细胞结构清晰、排列整齐、连接紧密；AngⅡ泵入28 d后，心肌细胞结构疏松且有断裂，排列紊乱，炎细胞增多，有明显出血坏死。而CMN处理组心肌细胞结构相对清楚，排列稍齐，无炎细胞增多及出血坏死，以CMN-2组改变最为显著，见图1A。Masson染色提示：Masson染色下心肌细胞呈红色，胶原呈蓝色。AngⅡ泵入28 d后，心肌纤维化明显增加，可见大片蓝色的心肌胶原沉积于心肌细胞及血管周围；假手术组无明显胶原沉积；CMN组均见少量胶原沉积，以CMN-2组最少。见图1B。

2.3 CMN呈剂量依赖性对抗AngⅡ诱导的Ⅲ型胶原（ColⅢ）表达 免疫组化实验结果显示，ColⅢ是间质中细胞外基质的主要成分，正常心肌间质中仅见微量阳性表达；AngⅡ泵入28 d后，ColⅢ阳性表达较正常对照组显著增加，而CMN组较AngⅡ模型组ColⅢ表达显著减少。见图2。

2.4 CMN呈剂量依赖性激活心肌自噬蛋白LC3和p62活化 通过 Western-blot免疫印迹法检测皮下埋泵小鼠心肌组织中自噬相关蛋白的活化情况发现，AngⅡ刺激3 d，CMN-2实验组较AngⅡ模型组心肌中LC3表达显著活化，同时P62底物蛋白表达下降，提示心肌细胞出现自噬活化。见图3。

2.5 氯喹干预对抗CMN对心肌纤维化的治疗作用 进一步应用氯喹泵入给药进行自噬干预后，MASSON染色检测CMN-2组小鼠心肌损伤情况发现，氯喹给药后，CMN对小鼠心肌纤维化的治疗作用被抑制（图4A）。同时，应用免疫组化染色检测ColⅢ表达发现，氯喹干预后，CMN小鼠心肌纤维化显著增加。提示氯喹可能具有对抗CMN的治疗作用。进一步机制研究发现，提取氯喹干预3 d的心肌组织进行Western-blot免疫印迹法检测证实，CMN对心肌细胞LC3的表达仍呈明显活化，但P62蛋白表达也呈显著增加，提示氯喹干预组心肌细胞呈现显著的自噬抑制状态（图4B、C）。

3 讨论

随着患者心脏疾病的进展、RAAS系统的激活，释放的神经激素因子通过它们在心肌细胞外的受体转运进入心肌细胞内，最终进入细胞核激活相关的转录因子，如GATA4、MEF2、SRF、TGF-β1等，引起心肌细胞肥大、凋亡，心肌细胞间质纤维化等一系列病理改变，从而导致心室重塑，影响心脏的收缩和舒张功能，最终导致心力衰竭的发生。目前大量的研究表明，心室重塑在心力衰竭中发挥着决定性作用，其中变化最为显著的是：①一系列复杂的分子机制和细胞机制调节异常，最终导致心肌结构、功能和表形的变化；②以心肌细胞外基质的过度沉积和降解减少而导致的心肌纤维化[2,3]。心肌纤维化是以心肌间质成纤维细胞过度增殖和胶原纤维过度沉积为特征的心脏间质重构[4,5]，其主要表现为胶原浓度明显升高或胶原容积分数显著高于正常值，临床上主要包括修复性心肌纤维化和反应性心肌纤维化这两种类型。心肌纤维化导致心功能不全，是心功能由代偿期向失代偿期转变的重要病理过程，而成纤维细胞增殖在心肌纤维化中起重要作用[6]。心肌纤维化过程不是一个简单的病理过程，其受到TGF-β1、SAM、MAPK通道等多种分子系列的调控，而且可能有TNF-α、IL-1β、IL-6等多种炎症因子的参与。有研究表明，AngⅡ可以通过激活TGF-β1和MAPK通道等多种细胞信号通道诱导心肌成纤维细胞增殖、胶原沉积及细胞外基质的降解[7-9]。因此，探讨心肌纤维化发生的病理机制，寻找延缓或逆转心力衰竭心室重构的重要调控因子，为寻找防治心脏疾病后心室重塑的新方法提供有益的思路，成为目前研究的热点。

姜黄素是从姜黄属植物根茎中提取出的一种多酚化合物，是姜黄发挥药理作用最重要的活性成分[10]，是天然P300特异性组蛋白乙酰转移酶抑制剂，已被证明具有较强的抗氧化、抗炎、抗纤维化作用，从而具有治疗心力衰竭的潜在功能。血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂（ARB）和血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）通过抑制血管紧张素Ⅱ的水平和活性在临床上取得了良好疗效。大量的证据提示姜黄素具有多个分子靶点，如转录因子、生长因子及其受体、细胞因子和调节细胞增殖和凋亡的相关基因[11,12]。Sunagawa等[13]在心肌梗死后心衰的小鼠中进行了不同剂量姜黄素对心脏功能影响的实验，发现中等和高剂量组小鼠的左室短轴缩短率下降，组织学检查发现中等和高剂量姜黄素组的心肌细胞直径、血管周围纤维化以及超声心动图所测得的左室后壁厚度均下降，左室收缩功能得到改善。Wang等[14]在心肌梗死大鼠的研究中发现，姜黄素可以降低丙二醛，抑制MMPs的活性，从而防止细胞外基质的降解和减少胶原的沉积，通过TGF-β/Smad蛋白介导的信号传导途径抑制胶原的合成。姜黄素除了减少在缺血/再灌注过程中的心肌胶原合成和纤维化，还显著下调TGF-β1与磷酸化的Smad2/3的表达，以及上调Smad7，并且还能增加α平滑肌肌动蛋白肌成纤维细胞在损伤心肌中的表达。超声心动图显示，姜黄素能显著改善左室舒张末期容积、每搏输出量和射血分数，证明姜黄素可抑制不适应的心脏修复和保护缺血再灌注后心功能。Kim等[15]的研究同样发现，姜黄素具有预防和治疗心肌梗死的作用。Sunagawa等[16]曾在研究中发现，姜黄素联合依那普利可明显改善心肌梗死后心衰小鼠的心功能，并明显减少非梗死心肌细胞的肥大改变。

本次实验报道了姜黄素通过激活自噬抑制AngⅡ在抗心肌纤维化中发挥作用，发现CMN能够呈剂量依赖性地抑制AngⅡ引起的心肌纤维化的发生，其对心肌的保护作用可能与其调控心肌细胞的自噬活化有关。同时应用自噬的抑制剂氯喹进行干预后，CMN对心肌纤维化的保护作用受到明显拮抗，这一研究结果进一步明确了CMN对心肌损伤的保护作用；同时也提示其可能是通过激活心肌细胞的自噬功能对抗AngⅡ引起的心肌氧化应激损伤，达到心肌保护作用。

综上，我们通过对CMN心肌保护作用的研究提示自噬保护可能在心肌纤维化损伤调控中起重要作用，也可能成为心肌保护性药物研究的重要方向。

（本文图片见后插二

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Curcumin inhibits the myocardiac fibrosis via activation of autophagy

ZHAO Ming＊，CHEN Jin-ru，HAN Xiu-min，et al.＊Department of Congenital Heart Disease，General Hospital of Shenyang Military Area Command，Shenyang 110016，China

HAN Xiu-min，E-mail：xiuminhan@126.com

Objective To evaluate the effect of curcumin on myocardial fibrosis and aims to explore the protective mechanisms of curcumin on myocardium.Methods AngiotensionⅡ（ANGⅡ）treatment was used to induce the myocardial fibrosis in mice.Echo was used to observe the heart function.HE and Masson staining was used to evaluate the area of myocardiac infarction and histopathological changes.The expression of collagenⅢ was estimated by immunohistochemical study.The expression levels of LC3 and p62 were estimated by Western blotting. Results Echo analysis showed that CMN protects against reduction of ANGⅡ-induced heart function in a dosedependent manner.HE and Masson staining revealed that myocardial fibrosis was inhibited in CMN-treated mice compared with that untreated mice.Meanwhile，collagenⅢ expression also identified to decrease in CMN-treated mice heart compared with that in untreated heart.Western blotting implicated that autophagy associated genes LC3 and p62 activation in heart tissue with CMN treatment.Using chorolquine to antagonize the autophagy activation，the fibrosis exist in the heart and autophagy accumulation.Conclusion Curcumin inhibits myocardial fibrosis by activation of autophagy in mice heart.

Curcumin； Myocardial fibrosis； Autophagy

辽宁省科学计划项目（项目编号：2011225021）

110016 辽宁省沈阳市，沈阳军区总医院先心病内科（赵明、陈锦铷、韩秀敏、武琼），医学实验科（孙英慧）；大连医科大学硕士研究生（陈锦铷、武琼）

韩秀敏，E-mail:xiuminhan@126.com

10．3969/j．issn．1672－5301．2017．05．023

Q95-33；R542.2

A

1672-5301（2017）05-0470-05

2016-10-27）