16S rDNA克隆文库方法分析太岁样品中细菌的多样性

王朝江

(河北省农林科学院 遗传生理研究所，河北 石家庄 050051)

16S rDNA克隆文库方法分析太岁样品中细菌的多样性

王朝江

(河北省农林科学院 遗传生理研究所，河北 石家庄 050051)

通过构建16S rDNA克隆文库的方法，分析太岁样品中细菌的群落结构及多样性。太岁样品中的细菌归属于4个门9个目，优势类群依次是芽胞杆菌目(Bacillales，33.01%)、柄杆菌目(Caulobacterales，32.04%)和伯克霍尔德氏菌目(Burkholderiales，12.62%)；优势属为短波单胞菌属(Brevundimonas，30.10%)、葡萄球菌属(Staphylococcus，29.13%)和食酸菌属(Acidovorax，7.77%)。并且其中的5个目中含有未培养的细菌，红杆菌目(Rhodobacterales)、伯克霍尔德氏菌目和红环菌目(Rhodocyclales)的11个克隆子的细菌16S rDNA序列同源性低于97%。研究表明太岁样品中细菌多样性较丰富，且蕴藏着许多未知的微生物资源。

16S rDNA；克隆文库；太岁；细菌多样性

“太岁”又称“肉灵芝”，《本草纲目》中描述为“肉芝状如肉，乃生物也，白者如截肪，黄者如紫金，皆光明洞彻如坚冰也”。太岁生活于土壤中，生命力极强，有研究称太岁在抑菌、调节免疫、恶性肿瘤等疑难杂症的治疗方面具有明显效果，因此受到社会各界的广泛关注。太岁特有的弹性、韧性和粘性，极易使人直觉上判定是一种生物体，但到目前为止生物学界却一直难以给出归属，比较流行的观点认为是“大型黏菌复合体”，但仍有人持太岁为非生命体的观点。戴璐[1]研究了渭河太岁衍生体中黏菌和真菌多样性，分离出2种黏菌和18种真菌；王欣[2]研究了上述同一样本中细菌多样性，获得35株细菌和1株黏细菌，优势菌群为β-变形菌纲伯克氏菌目(Burkholderiales)的细菌；林涧等[3]也开展了类似的工作；郑科研等[4]通过研究渭河太岁化学组成，推测其是以聚乙烯醇为主，含少量多糖和各种杂菌的不明物体；朱春玉等研究了太岁的营养组成，指出其含有核酸、蛋白质等基本生物体构成要素，倾向于支持太岁是生命体的观点[5]，但过低的核酸含量则不能确认其来源于太岁本身还是太岁中的杂菌。本文作者[6]在分析了中国现代太岁228次发现报道后，明确了太岁存在的客观性和研究的必要性。因此，进一步分析各种太岁中微生物的多样性及其与太岁本体的关系，为认识太岁属性、揭示生命特征提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试样品 太岁由北京电视台科教节目记者转赠，外观白色肌纤维状，手触有弹性，并略有粘性，发现地为吉林长春，笔者保藏编号004。

1.2 方法

1.2.1 总DNA提取 为减少外界杂菌的影响，测试取样切自有胶质层包裹的边缘紧密组织。切块用无菌水震荡洗涤200次，无菌滤纸吸干表面水分，切去暴露的表层，剩余部分用于DNA的提取。太岁切块组织匀浆机捣碎后，用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取总DNA。

1.2.2 PCR扩增 以提取的DNA为模板，采用16S rDNA扩增通用引物7F(CAGAGTTTGATCCTGGCT)和1540R(AGGAGGTGATCCAGCCGCA)进行PCR[7]。PCR反应体系：5×Buffer(with Mg2+)2.5 μL，dNTP(各2.5 mmol/L)2 μL，7F(10 μmol/L)0.5 μL，1540R(10 μmol/L)0.5 μL，TaqDNA聚合酶0.2 μL，DNA模板0.5 μL，加ddH2O至25 μL。PCR反应条件：98 ℃预变性3 min；98 ℃变性25 s，55 ℃复性25 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。

1.2.4 16S rDNA克隆文库分析 测序结果用Mothur 软件剔除嵌合序列，划分操作单元(Operational Taxonomic Unit, OTU)。通过Shannon-Wiener多样性指数(H)[8]及均匀度指数(E)分析细菌的多样性。

E= H / ln S

其中N为阳性克隆子总数；n1为仅含单个克隆子的OTU数量[9]。

1.2.5 构建细菌16S rDNA系统发育树 测序结果利用BLAST软件(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/blast/Blast. Cgi)与GenBank数据库中的序列进行比对分析，选取同源性最高且合格发表的菌株序列，利用MEGA5软件，采用邻接法(neighbor-joining method)构建系统发育树，代表克隆文库序列提交GenBank。

2 结果与分析

2.1 总DNA提取和PCR扩增

对太岁样品提取的总DNA进行电泳检测，条带大小为2 000 bp左右，DNA片段完整，并用细菌16S rDNA的通用引物7F和1540R扩增16S rDNA片段，结果如图1所示。由图1可知，16S rDNA片段约1 500 bp。

2.2 太岁样品16S rDNA文库的多样性

随机挑取太岁样品16S rDNA克隆文库中103个阳性克隆子，并进行测序(序列长约为800 bp),结果如表2所示。代表克隆文库序列提交GenBank，序列登录号为：KX579862～KX579878和KX686139～KX686143。103个阳性克隆共分为22个OTU，其中9个OTU只含有一个克隆子，计算覆盖率C值为91%，说明本研究检出的微生物在一定程度上可以反映样品的细菌群落结构。计算Shannon-Wiener多样性指数H为2.22，均匀度指数E为0.72，由此可看出太岁样品中细菌多样性较丰富且比较均一。

图1 太岁样品细菌16S rDNA的PCR扩增产物Fig.1 PCR amplification of the bacteria 16S rDNA from "Taisui"加粗的500、1 000、3 000分别表示Marker中相应条带大小为500 bp、1 000 bp、3 000 bp the size of stripes corresponded to bold Markers are 500 bp, 1 000 bp, 3 000 bp

由序列比对结果可知，太岁样品中细菌种类丰富，22个OTU共归属于4个门的9个目。其中变形菌门的67个克隆子所占比例最大(65.05%)，包含6个目：柄杆菌目(Caulobacterales)有33个克隆子，所占比例为32.04%；伯克霍尔德氏菌目(Burkholderiales)有13个克隆子，所占比例为12.62%；红环菌目(Rhodocyclales)有7个克隆子，所占比例为6.80%；根瘤菌目(Rhizobiales)有5个克隆子，所占比例为4.85%；红杆菌目(Rhodobac-terales)有5个克隆子，所占比例为4.85%；鞘氨醇单胞菌目(Sphingomonadales)有4

个克隆子，所占比例为3.88%。厚壁菌门的34个克隆子都归属于芽胞杆菌目(Bacillales)，所占比例为33.01%。疣微菌门的疣微菌目(Verrucomicrobiales)和浮霉菌门的浮霉菌目(Planctomycetales)都只有1个克隆子且为未培养细菌。由此可知，本研究太岁样品中最优势类群为芽胞杆菌目(33.01%)，次优势类群为柄杆菌目(32.04%)，然后是伯克霍尔德氏菌目(12.62%)。另外，本研究太岁样品16SrDNA克隆文库22个OTU中OTU5的31个克隆子为短波单胞菌属(Brevundimonas，30.10%)，是最优势属；OTU21的30个克隆子为葡萄球菌属(Staphylococcus，29.13%)，是次优势属；然后OTU1的8个克隆子为食酸菌属(Acidovorax，7.77%)；其他OTU所占比例均小于4%。

由表2可知，构建的16S rDNA文库中的克隆子与GenBank数据库中已知细菌的16S rDNA序列相似性最高为100%，最低为90%。其中92个克隆子(89.32%)与已知序列相似性高于97%，11个克隆子(10.68%)与已知序列相似性低于97%。本研究中16S rDNA克隆文库的5个目(红杆菌目、伯克霍尔德氏菌目、红环菌目、疣微菌目、浮霉菌目)中22个克隆子为未培养的细菌；3个目(红杆菌目、伯克霍尔德氏菌目、红环菌目)中11个克隆子与已知细菌的16S rDNA序列差异性较大，同源性最低的仅为90%，这说明太岁样品中不仅含有丰富的已知细菌，还蕴藏着许多未知及未培养的细菌，有进一步深入研究和开发的价值。

表2 太岁样品中细菌的16S rDNA克隆文库结果

续表2

2.3 太岁样品中16S rDNA系统发育分析

测序结果利用BLAST软件与GenBank数据库中的序列进行比对分析，选取同源性最高且合格发表的菌株序列，利用MEGA5软件，采用邻接法构建系统发育树，结果如图2。由图2可知，太岁样品克隆文库有22个OTU，其中21个OTU分别与变形菌门、厚壁菌门和疣微菌门的细菌聚集在一起，另有OTU22与浮霉菌门的未培养细菌聚集在一起，形成单独的一支，该结果与序列比对结果相一致。

图2 太岁样品中细菌16S rDNA克隆文库系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of bacterial 16S rDNA clones in "Taisui"

3 讨 论

本研究太岁样品16S rDNA克隆文库的103个阳性克隆子共得到22个OTU归属于4个门的9个目，其中优势类群依次是芽胞杆菌目(33.01%)、柄杆菌目(32.04%)和伯克霍尔德氏菌目(12.62%)。其中5个目的22个克隆子为未培养的细菌，3个目的11个克隆子细菌16S rDNA序列同源性低于97%，这说明太岁样品中的细菌不仅有较丰富的多样性，而且蕴藏着许多未知的微生物资源，有待进一步深入研究。

本研究太岁样品中细菌的优势属为短波单胞菌属(30.10%)、葡萄球菌属(29.13%)和食酸菌属(7.77%)。短波单胞菌属的琼脂糖酶产生菌能将琼脂降解为琼脂寡糖，琼脂寡糖具有抗癌、抗氧化、抗病毒等生理活性，被广泛应用于医药领域[10]。这可能与太岁对一些疑难杂症有特殊的疗效密切相关。另外短波单胞菌属细菌还能降解木质纤维素[11]、有机磷农药[12]和原油[13]等物质。这个属的细菌多见于水体中，有研究表明东居延海[14]和北极海水[15]中都是短波单胞菌属为优势种群。食酸菌属含有多种降解菌，能降解苯酚及苯衍生物[16]、腐植酸[17]、喹啉[18]、聚羟基丁酸戊酸共聚酯(PHBV)[19]和β-环柠檬醛[20]等难降解物质。以上结果表明太岁样品中细菌优势种群具有降解多种环境物质的作用，这可能与太岁在土壤环境中的生长有关，但仍需进一步研究。而葡萄球菌属细菌在太岁中的作用尚不清楚。

王欣[2]对渭河太岁衍生体中细菌多样性分析表明其体内的优势细菌种群为伯克氏菌目，而本研究太岁样品的伯克霍尔德氏菌目不是最优势细菌类群，所占比例为12.62%，芽胞杆菌目为本太岁样品的最优势类群。两个研究中优势菌群的不同可能与太岁样品不同、样品采集地及保藏处理方式不同有关。另外，林涧等[3]发现其太岁1号样品包含葡萄球菌属、白色侧齿霉菌、假丝酵母属，本研究太岁样品中的细菌也包含了葡萄球菌属。综合分析发现生长在不同环境中的太岁，其体内的微生物类群及优势种群存在差异，而不同太岁的细菌组成是否存在一定规律及差异形成的机理等还有待大量的研究证明。

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Analysis of Bacterial Diversity by 16S rDNA Clone Library fromTaisuiSample

WANG Chao-jiang

(Inst.ofGenetics&Physiol.,HebeiAcad.ofAgric. &ForestrySci.,Shijiazhuang050051)

The bacterial community structure and diversity ofTaisuisample were analyzed through the construction of 16S rDNA clone libraries. Bacteria inTaisuisample belonged to 4 phyla and 9 orders. The dominant orders of bacteria were Bacillales (33.01%), Caulobacterales (32.04%) and Burkholderiales (12.62%). The most dominant genus wasBrevundimonas(30.10%), the secondary dominant genus wasStaphylococcus(29.13%), followed byAcidovorax(7.77%). There were uncultured bacteria of 5 orders among them, and 11 clones from Rhodobacterales, Burkholderiales and Rhodocyclales of bacterial 16S rDNA sequence homology were less than 97%. The results indicated that high bacterial diversity was found inTaisui, also there were many unknown microbial resources.

16S rDNA; clone library;Taisui; bacterial diversity

王朝江 男，研究员。主要从事食用菌育种与栽培技术研究。Tel：0311-87652124，E-mail：lhswchj@163.com

2016-08-01；

2016-09-01

Q938

A

1005-7021(2017)03-0095-05

10.3969/j.issn.1005-7021.2017.03.015