抗生素与抗菌药物协同作用防控生物膜的研究进展

高志鹏， 陈康勇， 郭佳婧

(1.湖南农业大学 动物科学技术学院，湖南 长沙 410128；2.水产高效健康生产湖南省协同创新中心，湖南 常德 415000； 3.湖南省农业科学院 农产品加工研究所，湖南 长沙 410125)

抗生素与抗菌药物协同作用防控生物膜的研究进展

高志鹏1,2， 陈康勇1， 郭佳婧3*

(1.湖南农业大学 动物科学技术学院，湖南 长沙 410128；2.水产高效健康生产湖南省协同创新中心，湖南 常德 415000； 3.湖南省农业科学院 农产品加工研究所，湖南 长沙 410125)

生物膜(Biofilm)是指微生物为适应周围环境，黏附于介质表面并被其自身分泌的胞外基质包裹而形成的一种复杂的、高度异质的聚合结构。生物膜对宿主防御和药物具有很强的抵御能力，使用单一药物防治往往效果不显著，而利用协同作用将不同抗菌药物的优势联合起来用于生物膜的防控则优势明显。重点阐述了抗生素与抗生素、抗生素与中药、抗生素与噬菌体、抗生素与酶的协同作用研究，以期为生物膜的防控提供新思路。

协同作用；生物膜防控；抗生素；抗菌药物

生物膜是指微生物为适应周围环境，黏附于生命的或非生命的介质表面，并被其自身分泌的胞外基质包裹而形成的一种稳定的、紧密的、复杂的、高度异质的聚合三维网状结构[1]。细菌分泌的大量胞外聚合物使生物膜形成相对坚固严实的结构。研究表明，几乎所有的细菌都可以形成生物膜[2]，生物膜的形成基本分为5个时期：浮游状态、黏附、微菌落形成、成熟生物膜形成和离散。据统计，80%的细菌性疾病与细菌生物膜有关[3]，细菌可在人体组织如牙齿、皮肤、肺、尿道等器官的表面形成生物膜，导致一系列的感染并发症，可引起人类的许多慢性和难治感染性疾病，如龋齿、牙周病、慢性支气管炎、血栓性静脉炎、难治性肺部感染和心内膜炎等[4]。生物膜参与65%以上的感染，尤其是与医疗器械相关的、机体表面的(如皮肤、软组织等)和慢性感染，原因主要是生物膜对宿主防御和抗菌药物具有很强的抵御能力[5-7]。与浮游态细菌相比, 形成生物膜的细菌的标志性特性就是其成熟的生物膜具有很强的耐药性，其抗药能力甚至能达到浮游态细菌的1 000倍[8]。而已在体外药敏试验确定为有效的抗生素，也只能短暂缓解生物膜引起的疾病。因此，筛选适宜的防控生物膜的药物已成为研究热点。

目前，已经筛选出多种单一药物用于生物膜防控。例如，两栖动物皮肤抗菌肽和人胸腺素β4片段都具有抑制生物膜的活性，可用于研发抗铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)生物膜的药物[9-10]，阿奇霉素可有效抑制金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)生物膜的形成[11]。然而单一药物的使用存在毒副作用大，易产生耐药性等缺点，因此越来越多的研究探索利用不同药物的协同作用进行生物膜防控。协同作用将不同抗菌药物的优势联合起来，具有以下优势：减少各有效成分药物的用量；减轻剂量依赖性和毒性；增强治疗效果；加快药物的分解代谢速度。很多研究已经证实协同作用相对于单一药物作用的优势。例如,硝酸银与地衣芽胞杆菌(Bacilluslicheniformis)产生的脂肽类生物表面活性剂V9T14联合作用于大肠埃希菌(Escherichia coli)生物膜，发现二者联用时的硝酸银剂量比其单用时降低了99.2%～99.6%[12]。替加环素对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcusaureus, MRSA)有一定的抑菌活性，而当替加环素与庆大霉素联用时则可完全破坏生物膜[13]。根据研究中使用的协同药物的种类，本文从抗生素与抗生素、抗生素与中药、抗生素与噬菌体、抗生素与酶等角度阐述了协同作用在生物膜防控领域的应用，以期为相关研究提供参考。

1 抗生素与抗生素的协同作用

抗生素是人类对抗疾病的重要武器，然而抗生素的滥用却导致了细菌耐药性的出现。很多研究表明，即使某种抗生素对浮游态细菌有很好的控制或杀灭作用，但其在防控生物膜时效果并不理想，例如，对头孢他啶敏感的铜绿假单胞菌在形成生物膜后对头孢他啶产生耐药性，因为在生物膜的药物渗透屏障作用下，大部分抗生素因无法穿透生物膜与细菌接触而失效[14]。因此，许多研究者开始探索利用抗生素与抗生素的协同作用防控生物膜。利用一种抗生素在生物膜中打开“通道”，从而有利于另一种对生物膜内细菌敏感的抗生素通过“通道”杀灭生物膜内部细菌。例如，在体内和体外试验中，利福平与磷霉素联合使用可有效提高对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生物膜的抑制效果，磷霉素通过破坏生物膜的结构提高利福平对生物膜的渗透性[15]。大环内酯类抗生素如红霉素、克拉霉素、阿奇霉素和磷霉素均可抑制铜绿假单胞菌生物膜重要成分藻酸盐的合成和群体感应系统自身诱导分子的合成，从而使生物膜的结构受到破坏，导致生物膜上形成通向生物膜内部的“通道”，消除了药物渗透屏障，使协同药物美洛培南、喹诺酮类抗生素可以利用“通道”穿透生物膜，达到杀灭生物膜内部细菌的目的[16-17]。由此可见,“打开通道”主要是指抑制生物膜基质的形成和破坏生物膜的结构。总之，抗生素与抗生素的协同作用不但能降低细菌的耐药性，而且克服了药物剂量依赖性，对于生物膜的防控具有重要意义。

2 抗生素与中药的协同作用

菌耐药性的产生是在抗生素选择性压力下，细菌为了适应环境发生变异而进化的结果。而中药作为新型抗微生物因子和协作药物的有效资源，具有毒副作用小、不易产生耐药性、效果持久等优点[18]。五倍子、黄芩、黄连、黄柏、金银花、穿心莲、连翘、吴茱萸、龙胆草、大黄、鱼腥草等中药都具有显著的抗菌作用。中药与抗生素联合使用在防控生物膜方面有不同程度的增效作用，中药能介导抗生素进入生物膜，并且提高耐药菌对抗生素的敏感性，降低细菌对固体介质表面的黏附能力，使抗生素最大限度地杀灭细菌，从而有效防控生物膜[19]。目前，抗生素与中药的协同作用研究主要是围绕铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌开展的。例如，金银花水煎液在体外能降低铜绿假单胞菌对固体表面的黏附能力以及生物膜形成能力，并破坏已形成的生物膜，增强庆大霉素对生物膜内部细菌的清除作用[20]。穿心莲内酯能增强铜绿假单胞菌生物膜通透性，有利于左氧氟沙星渗进生物膜内的细菌，提高左氧氟沙星对铜绿假单胞菌的抗菌活性[21]。此外，以金银花为主要成分的双黄连溶液、中药提取物银翘散、黄芩提取物黄芩苷、鱼腥草素钠、苦参水溶液、大蒜素等中药均能与抗生素协同作用于铜绿假单胞菌生物膜。五倍子提取物可降低金黄色葡萄球菌生物膜活性，破坏其结构完整性，与克林霉素联合使用可显著提高钛板表面金黄色葡萄球菌生物膜的清除率[22]。单用五倍子对浮游态的金黄色葡萄球菌有很好的抑菌和杀菌作用，但对生物膜内部细菌作用较弱，而阿奇霉素可降低细菌的黏附能力，抑制生物膜的形成，有效促进五倍子穿透生物膜，五倍子与阿奇霉素联合使用显著增强了对金黄色葡萄球菌生物膜的防治效果[23]。穿心莲内酯、黄芩苷、黄芩素等中药提取物都具有抗金黄色葡萄球菌生物膜的特性，可为抗生素与中药的协同作用提供参考。然而中药防控生物膜的作用机理尚不明确，关于中药如何干预生物膜的形成、群体感应系统、细胞内信号转导和基因表达等方面的研究还处于初级阶段。因此，在筛选具有良好协同作用的中药的同时，应加强其作用机理方面的研究。

3 抗生素与噬菌体的协同作用

噬菌体(Bacteriophage)在自然界中分布广泛，是指一类能特异性感染细菌、真菌、放线菌和螺旋体等微生物的病毒的总称。相比抗生素,噬菌体防治生物膜具有用量少,疗效高,可作用于不同成熟程度生物膜等方面的优势。噬菌体可裂解细菌的细胞壁，并快速繁殖、释放大量子代噬菌体，从而短时高效地破坏生物膜[24]。在此反应过程中，主要效应物质是噬菌体释放的裂解酶，裂解酶能降解生物膜胞外多糖等主要成分，破坏细菌细胞壁结构，使宿主菌破裂而被杀灭。利用噬菌体分泌裂解酶降解生物膜的这种特性，可以通过噬菌体与抗生素的联合使用进行生物膜防控。例如，噬菌体PaP3裂解酶在体外可以特异性地降解铜绿假单胞菌生物膜的胞外多糖，有利于乳酸环丙沙星、加替沙星、头孢他啶、硫酸庆大霉素等抗生素穿透生物膜并作用于生物膜内部细菌[25]。噬菌体裂解酶通过水解细胞壁肽聚糖发挥裂解作用，消除生物膜的保护屏障，进而有利于抗生素杀灭生物膜内细菌；同时通过结合结构域与细菌表面受体结合，侵染生物膜内部细菌[26]。金黄色葡萄球菌噬菌体SAP-26联合利福平能够破坏生物膜基质，杀灭生物膜内细菌，从而有效促进金黄色葡萄球菌生物膜的降解[27]。Yilmaz等[28]用大鼠建立了由置入物引起的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的感染模型，分别运用特异性噬菌体Sb-1、替考拉宁、噬菌体Sb-1和替考拉宁联合治疗，结果只有噬菌体Sb-1联合替考拉宁的实验组没有生物膜形成，说明噬菌体Sb-Z与替考拉宁有很强的协同作用。

然而，噬菌体对其靶细菌的特异性限制了噬菌体的应用，大量研究开始通过基因工程等方法获得具有特定功能的噬菌体。经过基因改造的噬菌体与抗生素协同作用不仅能高效降解生物膜，还能有效降低生物膜对抗生素的耐药性，是防控生物膜的重要方法。Lu等[29]对M13mp18噬菌体进行改造，让其大量表达SOS修复系统抑制物lexA3，并将改造的噬菌体与氧氟沙星联合作用于大肠埃希菌，显著降低了大肠埃希菌的生物膜形成能力和耐药性。Pastagia等[30]通过基因工程等方法，将来源于噬菌体的溶菌素与抗生素组装，从而特定地作用于耐甲氧西林和万古霉素的金黄色葡萄球菌、耐万古霉素的粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)和耐青霉素的肺炎链球菌(Streptococcuspneumonia)，组装后的噬菌体可有效杀灭生物膜内部的细菌。通过基因工程改造的噬菌体与抗生素的协同作用在处理生物膜方面应用前景广阔。

4 抗生素与酶的协同作用

酶是一种具有生物催化功能和降解作用的蛋白质，具有毒性低、高效等特点。通过酶与抗生素联合使用可高效地清除生物膜。例如，Benzonase是一种非特异性高效核酸内切酶，能将生物膜基质中的胞外DNA降解，破坏生物膜的稳定性结构，分别与庆大霉素、利福平、万古霉素联合作用于金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)生物膜，可有效杀灭生物膜内的细菌，其生物膜内的活菌数下降程度显著高于抗生素单独处理组[31]。N-乙酰氨基葡萄糖苷酶Nag1可特异性降解金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌生物膜的胞外多糖，与氨苄西林联合使用能恢复生物膜对抗生素的敏感性，提高氨苄西林对生物膜内部细菌的杀灭能力[32]。藻酸盐裂解酶可通过减少烟曲霉菌(Aspergillusfumigatus)菌丝的厚度、干扰菌丝嵌入胞外多糖，从而促进两性霉素B进入烟曲霉菌生物膜内部，以此提高抗菌和抗生物膜活性[33]。藻酸盐裂解酶通过分解生物膜藻酸盐，并降低细菌黏附性，使生物膜的性下降,致密的胞外多糖变疏松或被清除，从而抑制细菌生物膜分化成熟，使抗生素等药物更容易渗透进入生物膜内部并杀灭细菌[34]。上述研究充分体现了抗生素与酶的协同作用在生物膜防控中高效、低毒、有效降低抗菌药物剂量的特点，因此抗生素与酶的协同作用是一种环境友好、经济节约的生物膜防控方法。

5 其他协同作用

5.1 超声波与抗菌药物的协同作用

超声波是一种机械压力波，作为传统的无创性设备，在很多领域都已得到运用。在防控生物膜过程中，超声波可以使不同接触表面的微生物脱落甚至失活，而且低频超声能显著增强抗生素活性[35-36]。例如，低频超声可增强庆大霉素对铜绿假单胞菌和大肠埃希菌生物膜的活性[37]，有利于骨水泥中释放的庆大霉素杀灭金黄色葡萄球菌与凝固酶阴性葡萄球菌(Coagulase-negativestaphylococci)生物膜内部细菌[38]。超声波与10%的磷酸三钠联合使用能增强超声波对鸡肉表面假单胞菌(Pseudomonadaceae)生物膜的清除能力，超声波处理破坏了生物膜结构，磷酸三钠可抑制细菌活性，使生物膜内部的细菌离散出来[39]。超声波可产生高压及高剪切力，增强细胞间的微对流，增高辐照区域局部温度，这些作用均可增强生物膜对药物的通透性，有利于药物作用于生物膜内细菌[40-41]。

5.2 EDTA与抗菌药物的协同作用

二乙胺四乙酸(Ethylenediaminetetraaceticacid,EDTA)是临床上治疗重金属中毒的常用药物，EDTA与钙、铁等金属离子的结合可抑制细菌生长和生物膜的形成，同时也可减少细菌产生的毒素因子。EDTA主要是通过破坏生物膜胞外多糖和细菌的细胞壁，利于抗生素等药物的渗入发挥杀菌作用[42]。例如，EDTA与庆大霉素联合使用可有效抑制多重耐药性的铜绿假单胞菌生物膜的形成[43]。 EDTA与环丙沙星和氨苄西林联合作用于黏液型铜绿假单胞菌生物膜，可使环丙沙星和氨苄西林的最低抑菌浓度降低30倍，EDTA通过和细菌细胞壁脂多糖上的镁离子结合，促进脂多糖释放，从而增加细胞的通透性，加快药物的渗透[44]。EDTA与美婷或亚甲基蓝联合使用能有效破坏水霉菌(Saprolegnia)生物膜结构、促进药物的渗透，作用效果明显优于美婷及亚甲基蓝单独使用[45]。可见EDTA与其他药物的协同作用对生物膜的防治具有重要意义。

5.3 酶与酶的协同作用

不同的酶清除生物膜的机理不同，它们的协同作用可破坏生物膜基质的不同成分，或者同一成分的不同化学键，使生物膜的结构从多方向受到攻击，从而最大限度地清除生物膜。例如，由糜蛋白酶和链道酶组成的复合生物酶，能水解生物膜基质，有效降解清除铜绿假单胞菌生物膜[46]。链球菌激酶和链球菌脱氧核糖核酸酶联合应用对金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌生物膜具有显著的抑制作用[47-48]。蛋白酶与多糖降解酶联合使用能够有效去除黏附在不锈钢材质上的大肠埃希菌生物膜[49]。酶与酶的协同作用是生物膜防治的重要研究方向，但由于酶的价格相对较高,产量较低，同时酶的生产没有达到专门化、集约化，使其未能广泛应用。

本课题组在迟缓爱德华氏菌生物膜相关研究中发现，EseB(Ⅲ型分泌系统输送器蛋白)在迟缓爱德华氏菌表面形成一种胞外纤丝结构，这一结构介导了生物膜的形成。与此同时，验证了抗EseB抗体对生物膜的防控作用，结果发现抗EseB抗体能够抑制生物膜的形成，随抗体浓度增加，生物膜形成能力逐渐降低[50]。这表明抗体是一种潜在的生物膜防控药物，接下来将研究抗体与抗生素、中药等药物的协同使用在生物膜防控中的作用，以期为生物膜的防控提供更多有效的措施。

6 展 望

抗生素与抗生素的协同作用：目前抗生素依然是防控生物膜的主要药物，但细菌耐药性的产生是限制其发展的重要因素，因此探索合理的协同作用药物种类和使用剂量，寻找特异性药物靶点和新型抗生素，将是今后使用抗生素防控生物膜的研究重点。

抗生素与中药的协同作用：国内外防控生物膜研究多侧重于抗菌西药的研发，而对中药的开发还很有限。相对于其他协同作用，中药及其有效成分联合抗生素在生物膜防控中已显示良好效果，同时细菌不易对中药产生耐药性，这些都证明了中药具有良好的应用前景。今后应加强防控生物膜中药及其有效成分的筛选，探讨其破坏或抑制生物膜的靶点和作用机理研究。

抗生素与噬菌体协同作用：虽然我国噬菌体裂解酶资源丰富，且裂解酶易于批量生产、提纯，但是仍然存在许多因素制约着噬菌体防控方法研究的发展。国内外相关研究较少且不够深入，缺乏明确的作用机理。噬菌体还存在宿主谱窄、研发成本高等问题。通过基因工程构建能表达高效、环保、无毒的噬菌体裂解酶的工程菌将是今后研究的重点。

抗生素与酶协同作用：抗生素与酶协同作用研究还处在初级阶段，酶具有的特异性、生物膜复杂的成分和结构为研究提供了重要的突破点。因为生物膜基质同一成分可以被多种不同的酶分解，同时一种酶又可以分解不同的成分，这就提供了多方面的研究方向。随着研究的深入会发掘出更多用于生物膜防治的高效、广谱的酶。

目前，虽然在抗生素与抗菌药物协同作用防控生物膜领域已经进行了许多研究，但还有很多工作需要继续开展。一是对生物膜性质及对生物膜内细菌的生理和分子特征进行深入研究，为协同药物的筛选、协同作用机理等研究奠定理论基础。二是对协同作用机理的研究还很匮乏，协同作用对生物膜信号传递系统、发挥作用的具体靶点、群体感应系统、耐药基因、蛋白表达谱的改变等方面都缺乏细致研究，今后需要开展更多的研究以阐明不同药物协同作用的详细机理。三是目前对于协同作用防控生物膜的研究多局限于体外实验，而体外实验与体内实验依然存在一定的差异，因此对于体外实验效果良好的协同药物，需要通过体内实验做进一步验证。四是需要进一步拓展协同药物种类，积极寻找特异的药物作用靶点，并通过化学合成或基因工程的方法研制多靶点药物，这将是未来防控生物膜的重要方向。

Advances in Synergy of Antibiotics and Antibiotic Medicine to Prevent and Control Biofilm

GAO Zhi-peng1, 2, CHEN Kang-yong1, GUO Jia-jing3

(1.Coll.ofAnim.Sci. &Technol.,HunanAgric.Uni.,Changsha410128; 2.Collabor.Innovat′nCtr.forEffic. &HealthProduct′nofFish.inHunanProv.,Changde415000; 3.Inst.ofHunanAgric.Prod.Process.,HunanAcad.ofAgric.Sci.,Changsha410125)

Biofilm is a complex, highly heterogeneous, polymeric structure, in which microbial cells adhere to media surfaces and embedded in extracellular matrix secreted by their own to adapt surrounding environments. Biofilm is highly resistant to host defense and medicaments, and in most cases the effect of single drug is usually not significant, yet there are obvious advantages to use synergistic effect of different antibiotic medicine for biofilm prevention and control. The studies on synergy effects of antibiotics with antibiotics, antibiotics with traditional Chinese medicine, antibiotics with phages, antibiotics with enzymes were summarized in this article, so as to provide some new line of thinking for biofilm prevention and control.

synergy; biofilm prevention and control; antibiotics; antibiotic medicine

湖南省教育厅科学研究项目(16B125)；国家级大学生创新创业训练计划项目((G)SCX1510)；湖南农业大学青年科学

基金项目(15QN01)

高志鹏 男，讲师，博士。主要从事水产动物病原微生物学研究。Tel: 0731-84618176，E-mail：gaozhipeng627@163.com

* 通讯作者。女，助理研究员，硕士。主要从事食品微生物学研究。Tel: 0731-84698915，E-mail：guojiajing1986@163.com

2016-11-07；

2017-01-17

Q939.93

A

1005-7021(2017)03-0116-06

10.3969/j.issn.1005-7021.2017.03.019